Полиморфная палочка: Please Wait… | Cloudflare

Содержание

Мазок на полиморфную палочку – Вопрос гинекологу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 74 направлениям: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского онколога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, липидолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, подолога, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 96.37% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

ПОЛИМОРФНАЯ ПАЛОЧКА отзывы врачей отрицательные и реальные, развод или правда, цена в аптеке на 2022 22:26

Присутствие в мазке полиморфной палочки

Часто, чтобы выявить какие-либо неполадки в организме используются разные анализы, наиболее популярными из которых являются анализы мочи и крови. Однако, очень часто достаточно информативное представление даёт проводимой анализ на посев микробиологической флоры. Особенно это касается тех случаев, если надо выявить какие-либо заболевания мочевой системы у мужчин или у женщин.

Очень важным показателем в анализе является наличие так называемой полиморфной палочки. Что означает подобный показатель? Прежде всего следует обратить внимание тут на присутствие разных микробов, а также количество микроорганизмов в исследуемом мазке. Подробную информацию, вместе с другими результатами анализов можно использовать с той целью, чтобы произвести качественную диагностику многих заболеваний. Таким образом можно не только диагностировать, но также произвести исключение какой-либо опасной болезни.

Для того чтобы определиться с полиморфной палочкой следует немножко иметь представление о бактериологическом посеве, разобраться с термином микрофлоры. Обычно под микрофлорой подразумевают комплекс разных бактерий, которые в норме присутствуют в организме человека. Одни из них являются симбионтами, то есть могут нормально присутствовать в организме в определённом равновесии, и не вызывают каких-либо негативных последствий. Они могут быть даже жизненно важными и полезными. Например взять такой микроорганизм, как кишечную палочку, которая принимает достаточно большое участие в процессе переваривания еды. Также имеется определенный комплекс бактерий во рту, а также на половых органах, которые также нормально там уживаются. Обычно микрофлору следует разделить на полезную и вредную. Но это разделение весьма грубое, более популярна другая классификация которую мы рассмотрим, – здесь выделяются три категории.

Нормальная микрофлора. Она необходима для поддержания нормальной жизнедеятельности функционирования органов, и является для организма даже жизненно необходимой. Многие бактерии выполняют защитную роль в организме, и даже поднимает иммунитет. Вторым типом флоры является условно-патогенная микрофлора. От нее никакой пользы для организма нету, но вреда она также не приносит. Однако иногда бывают ситуации, когда иммунные силы организма ослабляются, например в результате стресса или переохлаждения, и в результате этого начинается усиленное размножение этих условно-патогенных микробов. Они выделяют продукты жизнедеятельности, которые угнетают необходимую полезную микрофлору, и в результате этого происходит серьёзный сбой. От него нарушается нормальное функционирование организма, и появляются всевозможные заболевания. Поэтому даже банальный дисбактериоз может стать достаточно опасным для организма, вызвав массу сопутствующих болезней и инфицирование. Наконец следует отметить патогенную микрофлору, которая представлена бактериями, которые негативно воздействует на наш организм. Если человек здоров, то благодаря своему иммунитету он может очень хорошо противостоять вредоносным бактериям. Однако если он не соблюдает правила личной гигиены, переохладился, переволновался, у него упал иммунитет то больше шансов подхватить какую-либо инфекцию, например вирус или бактериальное заражение. Таким образом, возникают инфекционные заболевания, которыми болеют человек, от банального гриппа до серьезных смертельных инфекций.

Полиморфная палочка является патогенным микробом, который может вызвать соответствующие негативные изменения в микрофлоре влагалища у женщин, также он может поражать шейку матки и цервикальный канал. Антагонистическое действие этому микробу проявляет палочка дедерлейна, которая является полезным представителем микроскопической флоры, она способствует тому что стенки влагалища не пересушиваются, а патогенные микробы не размножаются, в том числе и полиморфная палочка. Таким образом, если происходит уменьшение количества палочек дедерлейна, например когда имеет место дисбактериоз во влагалище, то это является достаточно неблагоприятным фактором для организма. Таким образом, когда исчезает данная палочка, ее место начинает занимать полиморфная палочка. В данном случае в крови наблюдается появление лейкоцитоза, а именно лейкоциты отвечают за борьбу с вредоносными микробами, это сразу должно насторожить специалиста. Данный фактор позволяет врачу сделать определенный вывод, что организм поражён инфекционным процессом, или происходит там воспаление.

По какой симптоматике определяется наличие полиморфной палочки?

Обычно палочку определяют при помощи бактериологического мазка, когда производится его изучение на микрофлору. Однако существуют и другие факторы, которые дают знать о том, что необходимо обратиться в поликлинику и сделать соответствующие анализы. Не все изменения микрофлоры в данном случае проявляются внешней симптоматикой. Прежде всего следует обратить внимание на то, что из влагалища будет выходить большое количество выделений, которые могут быть окрашены в разные цвета, например желтоватый сероватый или беловатый. В любом случае если произошло изменение цвета выделений от стандартного, что-то поменялось, обязательно это должно обратить на себя внимание и нужно показаться специалисту. Далее следует обратить внимание на запах влагалищных выделений. Если он кисловатый, чем-то напоминает молоко, которое прокисло, а ещё если он сходен с запахом кислой рыбы, то это однозначно свидетельствует о серьезном сбое в организме. Далее, важно обратить внимание на дискомфортные ощущения в области половых органов, а также промежности. Если здесь намечается появление зуда, дискомфорта, ощущение жжения. Это свидетельствует о том, что разбушевалась патогенная флора. Также настораживает в данном случае проведение полового акта, который сопровождается болевыми ощущениями разной интенсивности. А после него остаются очень неприятные ощущения.

Во время мочеиспускания характерно появление дискомфортных состояний, боли или жжения. В более тяжелых случаях из влагалища наблюдается выхождение неприятных выделений, которые часто окрашены в зеленовато желтый или зеленый цвет, с примесью гноя. Также могут нередко наблюдаться боли в области низа живота, которые могут носить тянущий ноющий характер. Подобная симптоматика может свидетельствовать не только в наличии полиморфной палочки, но и многих других гинекологических заболеваний, а это может установить только компетентный специалист, который направит пациента на прохождение различных анализов. Это может быть кольпит, вагиноз, а также инфекционные болезни, которые передаются половым путём. Очень часто наличие полиморфной палочки проявляется в результате вагинального дисбактериоза который является проявлением разных сбоев функционирования организма. Если женщина беременна, то на большое количество данной палочки следует особо обратить внимание, поскольку это может представлять существенную опасность как для организма женщины так и для будущего ребенка.

Перед применением обязательно проконсультируйтесь со специалистом


Видео обзор

Все(3)
Что нашли у меня в мазкахМазок на флору: как расшифровать самостоятельноКальцинаты в легких – определение, причины образования, выявление, лечение и последствия  

Полиморфная палочка – Здоровье и здоровый образ жизни

О чем говорит показатель полиморфной палочки в мазке?

Один из важных показателей, оценивающих состояние микрофлоры в половых органах у мужчин и женщин, – полиморфная палочка в мазке.

Данный параметр определяет наличие и количество бактерий разных видов в исследуемом материале. В сочетании с другими показателями содержание полиморфной палочки помогает выявить или исключить возможную патологию.

В симбиозе с человеческим организмом живет множество самых разных бактерий. При поддержании баланса все вместе они образуют нормальную микрофлору. Бактерии живут на слизистых ротовой полости, кишечника и половых органов.

Всю флору в человеческом организме можно условно разделить на:

Нормальная флора поддерживает полноценную работу органов. Полезные микроорганизмы выполняют защитные функции и способствуют общему поднятию иммунитета. Подобная флора необходима для нормального функционирования организма.

Условно-патогенная микрофлора не приносит пользы, но в небольших количествах и не мешает.

Если же под влиянием каких-либо негативных факторов бактерии и грибки начинают активно размножаться, то под воздействием продуктов их жизнедеятельности нормальная флора будет угнетаться, а органы не смогут полноценно функционировать.

Так, даже простой дисбактериоз влагалища без лечения может доставить женщине массу дискомфорта и создать благоприятную среду для развития инфекций, спровоцировав осложнения.

Патогенные бактерии оказывают резко негативное влияние на состояние организма.

Сниженный иммунитет, дисбаланс микрофлоры, несоблюдения правил личной гигиены и ряд других причин значительно увеличивают шансы на развитие инфекции, в то время как у здорового организма устойчивость к воздействию патогенных микробов значительно больше.

Мазок на флору позволяет женщинам определить изменения в микрофлоре влагалища. В профилактических целях рекомендуется проводить анализ не реже одного раза в год.

Для диагностики анализ на микрофлору влагалища рекомендуется сдавать, когда появляются:

  • необычные обильные выделения с кислым или рыбным запахом, серого, желтоватого или зеленого цвета;
  • творожистые образования;
  • постоянный зуд в области промежности;
  • болезненность, проявляющаяся во время мочеиспускания или при половом акте.

Нередко людей смущает запись в анализах о наличии в мазке полиморфных палочек. Это подразумевает, что во взятом для исследования материале находятся различные виды палочек.

Понятие полиморфные палочки – это общее название множества видов микробов, которое объединяет микроорганизмы, отличающиеся по размеру и имеющих форму палочек.

Все полиморфные палочки делятся на нормальные, условно-патогенные и патогенные.

Данный показатель может говорить и о здоровой микрофлоре, и о возникшей патологии. Поэтому нормы полиморфной палочки в мазке довольно относительны.

Скорее следует обратить внимание на содержание в мазке лейкоцитов и других микроорганизмов, в общем оценивая процентное соотношение показателей. Так можно выявить наличие патологии.

Точно идентифицировать конкретный вид бактерий при микроскопии мазка невозможно. Для этого делают более сложный анализ с проведением бактериологического посева на флору.

На основе посева можно определить чувствительность микроорганизмов к разным видам антибиотиков для дальнейшего лечения.

У здоровых женщин нормальный анализ на микрофлору влагалища представлен в основном палочками Дедерлейна – ацидофильными грамположительными бактериями. Это крупные и неподвижные лактобактерии, не образующие споры. Кроме палочек Дедерлейна, во влагалище находятся и другие виды бактерий.

Высокое содержание лактобациллярной флоры – это вариант нормы и говорит о здоровье женщины. В анализе допустимо незначительное количество лейкоцитов, эритроцитов и смешанной флоры.

Если содержание лейкоцитов не превышает 10 на 1 см 2 (во время беременности показатели могут быть немного выше), то это не указывает на развитие патологических процессов.

Незначительное количество разного вида мелких палочек в результатах анализов тоже не всегда говорит о патологии.

Смешанная флора у взрослых женщин, ведущих регулярную половую жизнь, возникает в периоды непосредственно перед и после менструации или из-за сбоя в работе яичников.

Из-за особенностей гормонального фона смешанная микрофлора может встречаться и у молодых девочек и женщин в климактеральный период.

Значительное количество мелких палочек говорит о развитии бактериального вагиноза или дисбактериоза влагалища.

Коккобациллярная флора в анализе часто сочетается с высоким количеством лейкоцитов при почти отсутствующих палочках Дедерлейна.

Коккобациллярная флора иногда тоже участвует в развитии бактериального вагиноза или появляется в результате венерических заболеваний. В некоторых случаях параллельно друг другу может идти несколько патологий сразу.

Бывает, что у женщин в мазке обнаруживается патогенная кишечная палочка. Эти бактерии провоцируют значительный дисбаланс микрофлоры влагалища, в результате чего возникают дисбактериоз или молочница.

Результаты исследования микрофлоры влагалища становятся известны примерно через пару дней, на основании чего врач может поставить диагноз и прописать стратегию лечения. Иногда достаточно одного анализа, но в некоторых случаях специалист назначает дополнительные процедуры, чтобы выявить причины патологических изменений или чтобы подобрать наиболее эффективные лекарственные препараты.

Лечение заболеваний половой сферы всегда стоит проводить вместе с партнером. Каждый должен сдать анализы и провести хотя бы профилактическую терапию.

Например, при выявлении кандидоза лечение назначается обоим постоянным партнерам, независимо от выраженности симптомов.

Нарушения микрофлоры половых органов часто протекает бессимптомно (особенно у мужчин). Так, партнер со скрытыми симптомами, не прошедший лечение, может снова и снова заражать второго, провоцируя бесконечные рецидивы.

В лечении микрофлоры половых органов часто прибегают к антибиотикам. Лекарства выпускаются в разных формах в виде таблеток или капсул (для орального применения), свечей, кремов или мазей (для местного решения проблемы). Для более эффективной терапии врачи могут сочетать разные препараты.

Если подход к лечению разных видов заболеваний половой сферы тоже разный, то профилактика для всех случаев примерно одинакова.

Болезни половых органов, связанные с нарушением микрофлоры влагалища, в первую очередь нужно стараться предотвратить.

Особенно профилактика важна в период беременности, ведь полученная инфекция может негативно сказаться на плоде.

Для этого необходимо соблюдать простые нормы гигиены. Женщина должна ополаскивать гениталии не реже одного раза в день.

Для водных процедур лучше использовать специальные очищающие средства, поддерживающие кислую среду во влагалище (обычные моющие средства могут уменьшать уровень кислотности, снижая местный иммунитет).

Нужно избегать спринцеваний (кроме тех случаев, когда их прописал врач в лечебных целях), так как при спринцеваниях из влагалища вымывается полезная флора.

Не стоит часто носить стринги и злоупотреблять ежедневными прокладками, так как это повышает риск развития условно-патогенной и патогенной микрофлоры.

К выбору половых партнеров следует относиться избирательно. Можно обезопасить сексуальные контакты, используя специальные кремы или другие средства защиты от инфекции.

Чтобы снизить вероятность заболеваний половой сферы, нужно укреплять общий и местный иммунитет и в общем проявлять заботу о своем здоровье: следить за режимом сна и бодрствования, обеспечить полноценный рацион и уменьшить количество стрессов.

У здоровой женщины микрофлора влагалища в основном представлена палочкой молочнокислого брожения Додерлейна. Молочная кислота, которая является продуктом ее жизнедеятельности и делает влагалищную среду кислой. Засчет этого происходит подавление излишнего размножения бактерий, которые присутствуют во влагалище постоянно, и могут способствовать появлению патологических состояний. Если во внутренних половых органах начинают развиваться патологические процессы, численность палочек Додерлейна сокращается, во влагалище заселяется многочисленная полиморфная микрофлора. В этом случае изменяется характер влагалищных выделений и увеличивается их количество.

Микроскопическое исследование выделений из мочеполовых органов дает возможность оценить микробную обсемененность, наличие и степень выраженности воспаления, состав микрофлоры, а также выявить специфические инфекции, передающиеся половым путем (гонорею, трихомониаз, кандидоз).

  • Выявление в мазке грамотрицательных парных кокков свидетельствует о гонорее;
  • присутствие ключевых или атипичных клеток характерно для дисбактериоза влагалища;
  • наличие мицелия или спор грибов говорят о кандидозе;
  • трихомонады характерны для трихомониаза.

На состав микрофлоры влагалища оказывают влияние хирургические травмы, опухолевые процессы, которые снижают сопротивляемость бактериальным инфекциям. Нормальная микрофлора также подвержена воздействию антибактериальных препаратов, широко применяемых в настоящее время. Отмечается рост видов микроорганизмов, проявляющих устойчивость к действию этих лекарственных средств.

У здоровых женщин репродуктивного возраста лактобактериальная микрофлора во влагалище составляет 95%, регулируя инвазию патогенных микроорганизмов. Во время климакса дефицит эстрогенов вызывает возрастные изменения, при которых сокращается количество лактобацилл и, соответственно, молочной кислоты. Происходит колонизация влагалища анаэробными видами энтеробактерий, чаще всего кишечной палочкой и представители микрофлоры кожи.

Женщина, проявляющая заботу о своем здоровье, минимум раз в год, должна посещать гинеколога, а в идеале каждые три месяца. При осмотре врач обязательно берет материал на исследование из цервикального канала, шейки матки и влагалища, чтобы определить уровень чистоты вагины и вовремя выявить болезнь. В норме микробная флора палочковая или смешанная, где основную часть присутствующих бацилл составляют полезные лактобактерии, выглядящие как палочки с толстой стенкой и имеющие одинаковый размер.

В смешанной флоре присутствуют лактобоктерии, которые и составляют большую часть бактерий

Забор мазка на анализ берется с помощью одноразового специального шпателя. Полученные соскобы наносятся на предметное стекло и отправляются в лабораторию, где окрашиваются нужным красителем, подсушиваются, а затем исследуются под микроскопом. Это микробиологический метод аналитики.

Он позволяет увидеть:

  • в мазке у женщины палочковую флору , что значит присутствие лактобактерий, грам-положительных бацилл, которые поддерживают кислую среду и подавляют размножение вредных бактерий;
  • плоский эпителий , которым выстланы слизистые, причем количество его изменяется в зависимости от дня менструального цикла;
  • лейкоциты , участвующие в уничтожении патогенных микробов;
  • слизь наблюдается как продукт работы желез, она необходима для подержания нормальной влажности;
  • возможно появление полиморфно палочковой флоры , что это значит для организма, рассмотрим ниже.

Анализ мазка проводится в лаборатории под микроскопом с использованием специальных красителей

В группу полиморфно палочковой флоры входят бациллы, имеющие разный размер и форму палочек, отличающихся от полезных образцов толщиной. Такие микробы гораздо мельче и получили название грамм-отрицательных.

Это провоцирует возникновение заболеваний, от дисбактериоза до воспалительных и инфекционных процессов.

Симптомы

Обнаруженная в мазке полиморфно палочковая флора в большом количестве сопровождается неприятными ощущениями в шейке матки и цервикальном канале. Сопровождается следующими симптомами:

  • наблюдается большое количество выделений светлого, серого или зеленоватого цвета, иногда даже гнойных;
  • проявляется неприятный кисловатый запах;
  • беспокоит зуд и дискомфорт;
  • болезненность при половом контакте;
  • неприятное ощущение при испражнении;
  • боль внизу живота и в промежности.

Очень часто женщины принимают вышеперечисленные признаки за молочницу и начинают лечиться самостоятельно, загоняя ситуацию в тупик. Этого делать нельзя категорически. При появлении малейших отклонений в работе половой системы, надо посетить женскую консультацию, чтобы установить причину и грамотно от нее избавиться.

Представители полиморфно палочковой флоры могут оседать на стенках влагалища в виде белого налета, который обнаруживает гинеколог при осмотре. Точно определить, что это за бацилла трудно, поэтому, как правило, назначается бактериоскопия. Исследуемый материал после забора помещается в специальную среду, где микробы прорастают. Это помогает определить все их разновидности и выявить не только вид возбудителя, но и чувствительность его к антибиотикам, способным его уничтожить.

На практике чаще всего используется оценка результатов аналитики исследуемого материала микробиологически, согласно чему выделяют следующие стадии чистоты:

  • 1 степень характеризует совершенно здоровую женщину, когда визуально определяется в мазке палочковая флора в большом количестве с примесью единичного эпителия и небольшого количества слизи;
  • 2 степень также присуща здоровым женщинам, но здесь к присутствующим в достаточном объеме лактобактериям и эпителию присоединяются единичные кокки. Такая ситуация не должна вызывать беспокойства, поскольку считается нормой и наблюдается у достаточного числа девушек, живущих половой жизнью;
  • 3 степень имеет не совсем благоприятную картину. В мазке преобладают кокки, палочек небольшое количество, повышается число лейкоцитов (более 10 в поле зрения), снижается работоспособность палочковой флоры, что это значит, догадаться не трудно: развивается воспалительный процесс;
  • 4 степень ознаменована наличием только кокков, палочек нет совсем, большое количество эпителия шейки матки, растущее число белых кровяных телец, увеличение выделений. Это указывает на возникновение бактериального кольпита.

В последнем случае для уточнения диагноза доктор может порекомендовать кольпоскопию, чтобы составить мнение об уровне поражения шейки и цервикального канала.

Врачи выделяют 4 стадии чистоты флоры

При проведении исследования мазка анализы попадают к врачу, а он после прочтения результатов, делает вывод о состоянии флоры и решает, есть ли патология, какие микроорганизмы в ней заинтересованы, и как привести лактобактерии в нормальное состояние. При этом рекомендовано лечение свечами или таблетками, при необходимости задействуются антибиотики.

Тяжелее победить такую проблему беременной женщине. С момента зачатия изменяется гормональный фон. Его колебания приводят к изменению соотношения микрофлоры во влагалище. Меняется среда, что дает возможность для развития бактерий, вызывающих воспаление или какую-либо инфекцию.

Хорошая палочковая флора при беременности — залог здоровья ребенка

Поэтому, что это такое палочковая флора в мазке у будущей мамы объяснять не надо. Это показатель здоровья ее и будущего малыша. Первое обследование женщины делается при взятии на учет, а затем повторяется дважды, в 30 и 36-37 недель. Все эти мероприятия помогают вовремя выявить и пролечить патологические процессы, чтобы предупредить заражение ребенка патогенными бациллами при прохождении его по родовым путям во время появления на свет.

Для достоверности мазка перед походом к врачу существует несколько моментов, которые стоит принять к сведению каждой женщине:

  • за три дня до посещения женской консультации воздержаться от половых контактов;
  • не спринцеваться;
  • не сдавать анализ во время месячных.

Чтобы палочковая флора в большом количестве жила во влагалище необходимо придерживаться следующих правил:

  • следить за чистотой половых органов, подмываться не менее одного раза в сутки;
  • использовать специальные средства интимной гигиены, не нарушающие кислую среду влагалища;
  • спринцевание делать только по назначению врача, поскольку при нем вымываются и полезные микробы;
  • не увлекаться стрингами и ежедневными прокладками;
  • при смене партнера пользоваться средствами защиты;
  • отладить режим труда и полноценного отдыха;
  • укреплять иммунитет всеми доступными способами;
  • разработать сбалансированный пищевой рацион;
  • по мере возможности избегать стрессовых ситуаций.

Таким образом, нормальным составом флоры у женщин считается смешанная или палочковая . Большое содержание палочковой флоры не должно вызывать опасений, а при наличии кокков, назначают соответствующее лечение.

Россельхознадзор – Полезная информация

 Листериоз – инфекционная болезнь человека и животных.

Возбудитель листериоза – Listeria monocytogenes – подвижная, полиморфная, грамположительная мелкая палочка (длиной 0,5-2,0 нм; шириной 0,3-0,5 нм) с закругленными концами. Листерии обладают сравнительно высокой устойчивостью, широко распространены во внешней среде, при низких температурах (+4 – +6°С) длительное время (до нескольких лет) сохраняются в почве, воде, соломе, зерне. Размножаются в почве, воде, молоке, мясе, силосе, а также в органах трупов.

Основным резервуаром возбудителя в природе являются многие виды диких и синантропных грызунов. Листериоз поражает домашних и сельскохозяйственных животных (свиней, мелкий и крупный рогатый скот, лошадей, кроликов, реже кошек и собак), а также домашнюю и декоративную птицу (гусей, кур, уток, индюшек, голубей, попугаев и канареек). Листерии обнаружены также в рыбе и продуктах моря (креветки).

При листериозе имеет место многообразие механизмов передачи возбудителя инфекции (фекально-оральный, контактный, аспирационный, трансплацентарный), основным из которых является фекально-оральный.

При выявлении в хозяйстве (в животноводческом комплексе, на ферме, в отделении, стаде, свинарнике, индивидуальном дворе и т.д.) больных листериозом животных хозяйство (отдельные корпуса животноводческих комплексов, фермы, отделения, свинарники, птичники, индивидуальные дворы и т.д.) объявляют неблагополучным по листериозу, если в нем выявлено заболевание животного листериозом на основании комплекса эпизоотологических данных и результатов лабораторных исследований.

Симптомы: у крупного рогатого скота последовательно — угнетение, вялость, снижение аппетита, серозно-слизистые выделения из носа; на 3—7 сутки некоординированные движения, судороги, буйства, парезы, потеря зрения, конъюнктивит, стоматит, аборты, задержание последа, мастит; у телят — септицемия. У овец доминируют нервные явления, повышение температуры до 40,5—41С, потеря зрения; длительность болезни до нескольких суток, аборты, маститы. У свиней — исхудание, анемия, аборты. У кур — сепсис. У нутрий чаще протекает в хронической форме у беременных самок и щенков до 2 мес.

Патологоанатомические изменения. Отек мозга, катаральное воспаление слизистых оболочек, дистрофия, очаги в печени, увеличение селезенки, лимфатических узлов. Дегенеративные изменения и некротические очажки в печени.

Диагностика. В лабораторию направляют трупы мелких животных или голову (головной мозг), печень, селезенку, лимфоузлы, абортированный плод и его оболочки.

В лаборатории проводят бактериологическое исследование, метод люминесцирующих антител, серологические исследования (РА, РСК, РИГА).

Дифференциальная диагностика. Злокачественная катаральная горячка, бруцеллез, вибриоз, трихомоноз, болезнь Ауески, бешенство.

Профилактика и лечение. Лечение: успешно в начальной стадии применять антибиотики тетрациклинового ряда, ампициллин, сульфаниламиды. Проводят симптоматическое лечение (сердечные, дезинфицирующие, вяжущие средства).

Для профилактики используется сухая живая вакцина из штамма листерий АУФ против листериоза с/х животных.

Ветеринарно-санитарная экспертиза. Патологически измененные органы, кровь и головы от больных листериозом животных направляют в техническую утилизацию. Туши и внутренние органы без изменений обеззараживают проваркой или направляют для изготовления вареных, варено-копченых колбас или консервов. Реализация мяса, субпродуктов и шпика от больных и подозрительных животных запрещена.

Симптомы гарднереллеза и схема лечения у женщин и мужчин в Москве.

Гарднереллез — заболевание половой сферы, лечение которого необходимо во избежание серьезных последствий. Возбудителем этого неприятного заболевания является неподвижная полиморфная палочка или гарднерелла, открытая в 1953 году. Чаще всего возбудитель заболевания выделяется у людей, ведущих довольно активную половую жизнь и часто меняющих партнеров. Узнать о симптомах гарднереллеза и схеме лечения у женщин и мужчин в Москве можно в клинике Медлайн-Сервис.

 Обследование для женщин

У женщин бактерии размножаются во влагалище, сопровождая рост своей колонии специфическим запахом рыбы и серо-желтыми выделениями. В хронической случаях заболевание протекает в стадиях ремиссии или обострения после менструального цикла. При отсутствии квалифицированного лечения гарднереллез вызывает постоянные воспалительные процессы на слизистой влагалища и дисплазию эпителия шейки матки, что может привести к раковым опухолям и сложному течению беременности и родов.

 

Клиники «Медлайн-Сервис» предлагает всем пройти диагностику на наличие гарднереллеза! Это несложная и безболезненная процедура, не требующая специальных манипуляций. Вы можете сдать анализы в любой день недели — в часы работы клиники «Медлайн-Сервис».

 Обследование для мужчин

Мужчинам также советуем пройти обследование на гарднереллез — и лечение гарднереллеза в случае выявления заболевания. Наши врачи применяют только современные и эффективные методики лечения антибактериальными препаратами. Дозировка лекарственных средств подбирается индивидуально в каждом случае с учетом показателей бактериологических посевов. Время лечения — от одной до трех недель, в течение которых пациент должен прекратить половые контакты и соблюдать диету без острых, жирных, копченых продуктов и, разумеется, без алкоголя. После проведения лечения необходимо провести контрольное исследование, чтобы исключить возможность рецидива.

 Диагностика и лечение

Диагностика и лечение гарднереллеза у женщин и мужчин в клинике «Медлайн-Сервис» не займет у вас много времени и денег, зато подарит уверенность в собственном здоровье! Помните, что 100% результат дает только лечение обоих половых партнеров. Конфиденциальность в нашей клинике строго соблюдается!

 

Отзывы:

Катерина:

Всегда хожу проверяться в «Медлайн»! Врачи — супер-воспитанные люди!

 

Николай:

Был в ночном клубе, познакомился в девушкой, а средства защиты не применил. Лечился в “Медлайн-сервис” – и очень доволен. Культурные врачи, недорогие услуги. Спасибо!

 

Чем человек может заразиться от насекомых, млекопитающих и птиц

текст Петр Харатьян
иллюстрации Галя Панченко

Туберкулез

Рисунок: Галя Панченко

Туберкулез — хроническая заразная болезнь, вызывающаяся видимой под микроскопом палочкой одного из трех типов: человеческого, крупного рогатого скота или птичьей. Каждая из них в высшей степени опасна для хозяина соответствующего вида, но может вызвать заболевание и у представителей других видов. Заразиться можно через дыхательные пути, реже — через пищеварительный тракт или поврежденную кожу. Туберкулез поражает в первую очередь легкие: длительный кашель с мокротой и кровью (на более поздних стадиях), лихорадка, ночная потливость. Источником заражения человека могут оказаться больные животные, зараженный ими воздух, продукты, произведенные из них.

Сибирская язва

Рисунок: Галя Панченко

Наиболее яркие симптомы сибирской язвы у человека — возникающие на коже, в месте внедрения бациллы, синевато-красные узелки, а затем вырастающие темно-красные пузыри, содержащие жидкость. После того как пузырек лопается, зона ткани, на которой он располагался, мертвеет, и вокруг возникают такие же узелки, а потом пузыри. На этом фоне быстро происходит общее заражение крови, поднимается температура. Без скорой медицинской помощи больной умирает. Источники заражения — кровь, мясо и кожа павших животных. Сибирской язвой болеют домашние, сельскохозяйственные и дикие животные, а также и люди.

Лептоспироз

Рисунок: Галя Панченко

Лептоспироз (или инфекционная желтуха) — заболевание домашних, сельскохозяйственных и некоторых диких животных, а также человека. Лептоспиры, бактерии-возбудители лептоспироза, обитают преимущественно в воде рек и озер и проникают в организм через пищеварительный тракт, слизистые оболочки или поврежденную кожу. Также они содержатся в естественных жидкостях больных и даже переболевших животных. Главный резервуар лептоспир в природе — грызуны. Симптомы болезни — сильный озноб, потеря сознания, бред, лихорадка, головные боли, боль в мышцах. Если начинается желтуха, на коже появляется зудящая сыпь. Поражаются печень и почки.

Туляремия

Рисунок: Галя Панченко

Туляремией болеют грызуны, пушные звери, сельскохозяйственные и домашние животные, а также человек. Наиболее распространенные переносчики возбудителя туляремии — кровососущие насекомые и клещи. Источником этой опасной инфекции являются также грызуны. Туляремию возбуждает мелкая полиморфная палочка, способная к длительному существованию вне организма (в воде при 13-15°С — 3 мес.; в замороженном мясе — до 90 сут.). Человек может заразиться во время купания, через кожу или слизистые оболочки. Поражаются преимущественно лимфатические узлы, легкие и селезенка, бывают лихорадки, головокружение, тошнота, бред, головная боль.

Бруцеллез

Рисунок: Галя Панченко

Наиболее распространенные источники бруцеллеза для человека — зайцы. Также болеют домашние животные, сельскохозяйственный скот, волки, лисицы, воробьи, голуби и проч. Человек может заразиться бруцеллезом через пищеварительный тракт, кожу и слизистые оболочки, после чего у него начинаются лихорадка и озноб, повышается температура (вплоть до 41°С), увеличиваются лимфоузлы; поражаются почти все внутренние органы и особенно сильно — суставы, что может привести к инвалидности и даже, в редких случаях, к смерти.

Бешенство

Рисунок: Галя Панченко

Бешенство — острое инфекционное заболевание, вызываемое невидимым под обыкновенным микроскопом вирусом, который передается здоровым животным или людям со слюной больного животного — при укусе. Бешенством могут заразиться практически все животные, даже птицы. При бешенстве поражается центральная нервная система, что вызывает повышенную агрессивность, парезы, параличи, судороги и т.п. Болезнь может не проявляться достаточно долго — от 12 дней до нескольких месяцев. Если срочно не вакцинировать укушенного бешеным животным человека, он может умереть менее чем за две недели.

Чума

Рисунок: Галя Панченко

Чумная палочка — бактерия, являющая возбудителем бубонной, легочной и септической форм чумы. Ее основными переносчиками в природных очагах являются грызуны, кошки и верблюды, а также разнообразные блохи. При чуме поражаются легкие, лимфоузлы и другие внутренние органы, развивается сепсис. “Юстинианова чума” (541-750 гг.) и “Черная смерть” (1346-1353 гг.) — наиболее известные пандемии чумы. Первая унесла десятки миллионов жизней, вторая — треть населения Европы. Обе чумы, как считается, пришли в Средиземноморье с территории Африки.

Токсоплазмоз

Рисунок: Галя Панченко

Возбудителем токсоплазмоза является паразитическое простейшее — токсоплазма. Человек может заразиться как от человека, так и от животного, а также быть лишь переносчиком токсоплазм. Передача возбудителя может происходить через пищеварительный и дыхательный тракты, внутриутробно, посредством контакта с больными, половым путем; заразны и естественные жидкости больного организма. Токсоплазмы переносят членистоногие: мухи, блохи, некоторые клещи и др. При острой форме у больного увеличивается печень и сильно повышается температура, как при тифе, либо поражается нервная система (судороги, рвота, параличи и др. симптомы). Есть предположение, что до 65% всего человечества заражено паразитами токсоплазмоза.

Листериоз — одна из опасных пищевых инфекций

Листериоз (Listeriosis)– зоонозная болезнь животных и человека, характеризующаяся поражением центральной нервной системы, септическими явлениями, абортами, маститами или протекающая в форме бессимптомного носительства. У домашних животных листериоз регистрируют почти в 60 странах мира, при этом летальность может достигать 98–100%.

Возбудитель широко распространен в окружающей среде и выделен более чем у 100 видов различных животных (сельскохозяйственных, домашних, диких, включая рыб и клещей). У человека наиболее часто эти бактерии вызывают пищевые инфекции. Патоген попадает в продукты питания и размножаются в них, что приводит к спорадическим случаям пищевого листериоза. Возбудитель зачастую вызывает широкий спектр оппортунистических инфекций (поражающих людей с ослабленным иммунитетом), а также перинатальных и неонатальных заболеваний человека. 

Практически повсеместное распространение листерий объясняется тем, что патогену свойственна высокая метаболическая пластичность, способность перехода от сапротрофного к паразитическому питанию, и наоборот.

Возбудитель болезни — Listeria monocytogenes – подвижная неспорообразующая полиморфная грамположительная палочка.

Листерии длительно сохраняются во внешней среде, способны размножаться в мертвых тканях и в силосе при низкой температуре. Они остаются жизнеспособными в отрубях и овсе до 105 дней, в сене и мясо-костной муке – до 134 дней; долгое время не погибают при низкой температуре в соленом мясе. Листерии погибают при воздействии раствора хлорной извести при содержании 100 мг активного хлора в 1л – через 1ч. Нагревание до 100°С убивает листерий за 5-10 минут, а до 75-90°С – за 20 минут.

Листерии широко распространены во внешней среде, в том числе в почве, воде, растениях. Их выделяют в различных климатических регионах планеты, даже за Северным полярным кругом. Возбудитель листериоза изолирован от 103 видов животных, в том числе рыб (пресноводных), рептилий, 15 видов птиц и более чем 90 видов млекопитающих. Последние представлены насекомоядными, грызунами, жвачными, приматами, а также водными животными.

Источник возбудителя листериоза – больные и переболевшие животные, которые выделяют возбудителя во внешнюю среду с мочой, калом, молоком, истечениями из носовой полости, глаз, половых органов, а также животные – листерионосители, играющие определенную роль в поддержании стационарных очагов болезни (дикие мелкие млекопитающие и птицы). Установлено листерионосительство у человека. Переносчиком инфекции листериоза могут быть кровососущие членистоногие (иксодовые и гамазовые клещи), а также различные виды блох и вшей. Листериозу свойственны природная очаговость и стационарность.

В естественных условиях заражение листериозом происходит через пищеварительный тракт, дыхательные пути, а также поврежденную кожу и слизистые оболочки половых органов.
Животные заражаются через корма и воду, загрязненные листериями, от грызунов, а также больных и переболевших животных.

Человек заражается в основном алиметарным путем через инфицированные овощи, некипяченое молоко, сыры и другие молочные продукты, недостаточно термически обработанное мясо, а также через зараженную воду, не подвергшихся термической обработке ранних овощей, собранных с участков, где использовали для полива необеззараженные сточные воды и навоз. Повышенную опасность представляют мягкие сыры, а также продукты быстрого приготовления («фаст фуд»). Особое значение имеет возможность передачи листерий от беременной женщины плоду. Возможно профессиональное заражение людей: ветеринарных специалистов, работников боен, мясокомбинатов и животноводческих ферм.

Профилактика листериоза животных. Исключительная важность профилактики листериоза подчеркивается зоонозным характером данной болезни и большой опасностью, которую она представляет для людей.

Листериоз чаще всего возникает в хозяйствах с плохими санитарно-гигиеническими условиями и плохо организованным кормлением. В связи с этим, чтобы не допустить возникновения данной болезни, особое внимание необходимо уделять организации правильного и полноценного питания (особенно в минеральном и витаминном отношениях), а также соблюдение всех санитарно-гигиенических правил содержания животных.

Профилактика листериоза людей включает контроль за продуктами питания, предусмотренный соответствующими нормативными документами; санитарно-просветительную работу среди населения, особенно групп риска. 

Специалисты ФГБУ «Краснодарская МВЛ» проводят исследования пищевой продукции, в том числе и на присутствие в продукте патогенной микрофлоры.

Источник: пресс-служба ФГБУ «Краснодарская МВЛ»

границ | Молекулярная и биохимическая характеристика YeeF/YezG, полиморфной пары белков иммунитета к токсинам из Bacillus subtilis

Введение

Хотя большинство микробов одноклеточные, они все же демонстрируют несколько сложных социальных черт, таких как общение, роящая подвижность, регуляция скоординированной экспрессии генов и т. д., подобно высшим многоклеточным организмам. Они конкурируют или сотрудничают с соседними микробами за ограниченное пространство и питательные вещества для выживания (Visick and Fuqua, 2005; Keller and Surette, 2006).В ходе эволюции микробы выработали несколько стратегий общения, конкуренции или сотрудничества друг с другом (Waters and Bassler, 2005; Keller and Surette, 2006; Aoki et al., 2010; Whitney et al., 2017). Чтобы ограничить рост конкурентов и способствовать родственному отбору, микробы выделяют несколько белковых и небелковых токсичных молекул (Zhang et al., 2011, 2012). Полиморфные токсины принадлежат к одному из этих разнообразных и широко распространенных семейств токсинов, продуцируемых бактериями, которые помогают ограничивать рост конкурентов, способствуют родственному отбору и формируют бактериальное сообщество (Zhang et al., 2011, 2012).

Группа Аравинда сообщила о всестороннем биоинформатическом анализе систем полиморфных токсинов (PTS) (Zhang et al., 2011, 2012) и предсказала многочисленные модули полиморфных токсинов и родственных белков иммунитета как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий. Полиморфные токсины представляют собой многодоменные белки, в основном участвующие в межбактериальных конфликтах (Zhang et al., 2011, 2012). Продукт гена иммунитета нейтрализует токсин и защищает токсин-продуцирующие клетки от аутоингибирования (Zhang et al., 2012). PTS имеют следующие характеристики домена: N-концевой домен трафика, центральный домен и высоковариабельный С-концевой домен. N-концевой домен переноса в токсине консервативен среди родственных токсинов, принадлежащих к тому же семейству, и участвует в экспорте токсина на внешнюю мембрану (Aoki et al., 2005; Zhang et al., 2011, 2012). . Необязательный центральный домен различается по длине и может содержать повторы нескольких нитевидных доменов, таких как гемагглютинин, рекомбинантная горячая точка и т. д.Роль центрального домена до сих пор не исследована, но, вероятно, этот участок способствует отображению токсического модуля на клеточной поверхности (Aoki et al., 2005; Zhang et al., 2011, 2012). Интересно, что N-концевая и центральная области консервативны в семействе PTS, но С-концевой домен сильно варьирует и относительно меньше по размеру, обладая токсической активностью (рис. 1А). С-концевой домен демонстрирует как последовательность, так и функциональное разнообразие с некоторыми из аннотированных функций, включая нуклеазы, порообразующие токсины, ферменты, модифицирующие нуклеиновые кислоты, пептидазы и ферменты, модифицирующие белок, такие как АДФ-рибозилтрансферазы (Aoki et al., 2005; Чжан и др., 2011, 2012; Джамет и Нассиф, 2015 г.). У бактерий было предсказано несколько семейств полиморфных токсинов/иммунитетов, но лишь некоторые из них были охарактеризованы экспериментально. Семейство PTS включает системы контактно-зависимого ингибирования роста (CDI) (Aoki et al., 2005, 2010), токсины горячей точки перестройки (RHS) (Poole et al., 2011) и токсины семейства множественной адгезии ( maf ) (Jamet et al., 2011). et al., 2015), которые изучались на грамотрицательных бактериях, тогда как токсины Pfam PF04740 (Holberger et al., 2012) изучали на грамположительных бактериях. Среди всех них CDI является наиболее изученным явлением, когда клетки CDI + ингибируют рост клеток CDI за счет прямого межклеточного контакта. CDI опосредуется кластером генов cdiBAI , где CdiA — молекула токсина, CdiB — предполагаемый белок внешней мембраны, который способствует экспорту токсина CdiA за пределы клеточной поверхности, а CdiI — родственный белок иммунитета (Aoki et al., 2005). , 2010; Хейс и др., 2014).Помимо этих основных компонентов фактор хозяина CysK также играет важную роль в опосредовании CDI в E. coli UPEC536 (Diner et al., 2012; Kaundal et al., 2016). В то время как о системах CDI сообщалось у грамотрицательных бактерий, в нескольких исследованиях наличие подобных систем у грамположительных бактерий упоминается как контактно-зависимый антагонизм (Koskiniemi et al., 2013; Jamet et al., 2017, 2018; Whitney). и др., 2017). Первое сообщение о контактно-зависимом антагонизме роста у грамположительных бактерий было опубликовано Koskiniemi et al.(2013), где было охарактеризовано семейство полиморфных токсинов WapA B. subtilis . С-концевой домен белка WapA содержит токсин и участвует в контактно-зависимом антагонизме роста восприимчивых штаммов. Уитни и др. (2017) сообщили, что токсины LXG (TelB и TelC), секретируемые системой секреции VII типа Streptococcus intermedius , грамположительных бактерий, обеспечивают конкурентное преимущество по сравнению с чувствительными штаммами S. intermedius и другими штаммами Gram. -положительные виды ( Streptococcus pyogenes и Enterococcus faecalis ).Затем эти токсины были нейтрализованы белками, кодируемыми генами непосредственно ниже telB и telC . Холбергер и др. (2012) выделили полиморфные токсиновые модули семейства Pfam PF04740 (семейство LXG) от грамположительных бактерий. Эти токсины проявляют ингибирующую рост активность при экспрессии в E. coli , а коэкспрессия родственного белка иммунитета нейтрализует токсичность и предотвращает аутоингибирование. Члены семейства Pfam PF04740 были охарактеризованы и выявили РНКазную активность в доменах YobL-CT, YxiD-CT и YqcG-CT из B.subtilis 168 (Holberger et al., 2012). Хотя С-концевой токсический домен YeeF был включен в исследование, он не был функционально охарактеризован (Holberger et al., 2012).

Рисунок 1. Схематическое изображение систем полиморфных токсинов. (A) Схематическое изображение, показывающее организацию системы полиморфных токсинов, участвующих в контактно-зависимом ингибировании роста грамотрицательных бактерий. Необязательная выделенная транспортная система может быть закодирована вблизи генов токсина/иммунитета токсина.В определенном семействе полиморфный токсин состоит из консервативной N-концевой области, имеющей транспортный домен, и вариабельной С-концевой области, которая кодирует различные модули токсина. Помимо домена-транспортера, более длинная центральная область демонстрирует высокую вариабельность длины и содержит различные комбинации доменов/повторов, таких как филаментозный гемагглютинин, рекомбинантная горячая точка и т. д. Эта центральная область также предположительно помогает в отображении токсина на поверхности клетки. Оперонная организация полиморфной токсиновой системы, участвующей в контактно-зависимом антагонизме у грамположительных бактерий. (B) Архитектура домена YeeF токсина YeeF. N-концевая область имеет сходство с консервативным надсемейством доменов LXG Pfam PF04740, которое необходимо для секреции токсина системой секреции VII типа (Whitney et al., 2017). С-концевой токсический модуль аннотирован как предполагаемая ДНК/РНК-неспецифическая эндонуклеаза. @ Спиральная область; # Область низкой сложности. Следует отметить, что представление архитектуры предметной области не соответствует масштабу.

Чтобы понять стратегии, используемые бактериями, чтобы превзойти своих конкурентов, мы предприняли попытку охарактеризовать один из неохарактеризованных белковых модулей иммунитета к токсину, члена семейства полиморфных токсинов Pfam PF04740 из B.subtilis подвид. Спизизении ул. W23 . С-концевой токсический домен из B. subtilis 168 имеет 82% идентичность последовательности с аннотированным YeeF-CT из Bacillus subtilis subsp. Спизизении ул. W23 охарактеризован в этом исследовании. Анализ биоинформатики и базы данных консервативных доменов позволяет предположить, что N-концевая область YeeF принадлежит консервативному Pfam PF04740 и содержит предполагаемый нуклеазный (предсказанный рибонуклеазным в UniProt KB) домен в своей C-концевой области (рис. 1A, B). .Мы провели подробные биофизические и биохимические исследования С-концевого токсического домена YeeF, далее называемого YeeF-CT, члена токсиновой системы PF04740 (рис. 1A, B). Здесь мы сообщаем, что YeeF-CT представляет собой ДНКазу, зависимую от ионов металла, которая нейтрализуется YezG, белком, кодируемым геном, расположенным ниже yeeF . Следовательно, YeeF/YezG образует функциональную пару токсин/иммунитет. Это исследование предполагает, что члены семейства PF04740 представляют собой нуклеазы, обладающие либо РНКазной, либо ДНКазной активностью.

Материалы и методы

Клонирование

yeeF-CT, yeeF-CT H 581 A и yezG Участок ДНК

, кодирующий yeeF-CT (диапазон остатков от Ile527 до Gly669), был клонирован в вектор pBADMyc-His A_Modi (модифицированный вектор, в котором введен сайт рестрикции Nhe I и N-концевые 6 × His-метка) между Nhe I и Hin dIII сайты рестрикции. Ген yezG клонировали между сайтами рестрикции Nde I/ Xho I в векторе pET28a с получением N-концевых белков, меченных 6× His.Точечный вариант yeeF-CT H 581 A , в дальнейшем именуемый yeeF-CT (M) , был создан с использованием сайт-направленного мутагенеза на основе ПЦР. Подробный список конструкций, использованных в настоящем исследовании, представлен в дополнительной таблице S1.

Кривая роста и подсчет КОЕ

Клетки

Escherichia coli BL21 (DE3), экспрессирующие YeeF-CT, YeeF-CT (M) , YeeF-CT/YezG и pBADMyc-His A_Modi (отрицательный контроль), выращивали в течение ночи при 37°C в среде LB с добавлением с соответствующими антибиотиками.Культуры, выращенные в течение ночи, разводили в свежей среде LB до OD 600 0,07, затем выращивали до OD 600 0,4 при 37°C и индуцировали 0,1% L-арабинозы. Экспрессию YezG индуцировали 0,3 мМ IPTG при 0,2 OD 90×101×600×90×102 перед индукцией YeeF-CT. ОП 600 для каждого образца измеряли и наносили на график в зависимости от времени. Для подсчета колоний образцы брали через 0, 1, 2 и 4 часа после индукции. Десятикратные серийные разведения, т. е. 10 –3 , 10 –4 и 10 –5 , готовили в среде LB, и 10 мкл разведенных образцов высевали на чашки с агаром LB с соответствующими антибиотиками.Планшеты инкубировали при 37°C в течение ночи, и колонии подсчитывали с использованием счетчика колоний (Heathrow Scientific) и строили график зависимости от времени. Опыты проводились в трехкратной повторности. И кривые роста, и данные КОЕ были построены с использованием программного обеспечения Origin 6.1, а неопределенности были рассчитаны с использованием стандартного отклонения.

Анализ SDS-PAGE

Клетки

осаждали и лизировали с использованием буфера для лизиса (20 мМ HEPES, pH 7,5, 150 мМ NaCl и смесь ингибиторов протеазы, не содержащих ЭДТА), обрабатывая образцы ультразвуком в течение 10 минут, и лизат разделяли на супернатант и осадок.Около 10 мкг общего белка из супернатантной фракции отделяли на полиакриламидном геле с ДСН и определяли окрашиванием красителем Кумасси.

Трансмиссионный электронный микроскоп (ПЭМ)

Клетки

Escherichia coli BL21 (DE3), экспрессирующие YeeF-CT, YeeF-CT (M) , YeeF-CT/YezG и pBADMyc-His A_Modi (отрицательный контроль), анализировали с помощью ПЭМ. Клетки выращивали, как указано выше в разделе «Материалы и методы», а затем собирали через 0, 30, 60 и 120 минут после индукции.Клетки дважды промывали 1 × PBS, ресуспендировали в PBS и по 30 мкл каждого образца наносили на покрытые углеродом медные сетки 300 меш (Polysciences, Inc.). Затем сетки высушивали на воздухе и загружали в держатель образцов, а затем визуализировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM 2100, работающего при 200 кэВ (JEOL).

Экстракция геномной ДНК и

in vitro ДНКазная активность

Клетки, экспрессирующие YeeF-CT, YeeF-CT (M) , YeeF-CT/YezG и pBADMyc-His A_Modi (отрицательный контроль), собирали при 12000g.Геномную ДНК выделяли с использованием мини-набора QIAamp DNA от QIAGEN. Очищенные образцы ДНК разделяли на 0,8% агарозном геле. Для анализов активности ДНКазы in vitro очищали YeeF-CT (250 нМ–2 мкМ) или YeeF-CT (M) (500 нМ–2 мкМ) и инкубировали с плазмидой (~180 нг) в буфере. (20 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl) при 37°C в течение 30 мин. Затем образцы разрешали на 0,8% агарозном геле и визуализировали в УФ трансиллюминаторе. Для проверки металлозависимой ДНКазной активности и идентификации иона металла, ответственного за активацию ДНКазной активности YeeF-CT, токсин хелатировали 10 мМ ЭДТА в течение 2 ч при комнатной температуре и подвергали диализу против буфера 20 мМ HEPES pH 7.5, 150 мМ NaCl в течение 12 часов. Диализованный YeeF-CT (2 мкМ) инкубировали с указанной концентрацией различных ионов металлов и тестировали на ДНКазную активность, инкубируя с плазмидной ДНК в течение 30 мин при 37°С. Чтобы исследовать защитную роль YezG, YeeF-CT (2 мкМ) предварительно инкубировали с различными концентрациями YezG (0,5–2 мкМ) в течение 45 минут при комнатной температуре, а затем инкубировали с ДНК. Чтобы увидеть оптимальное время, необходимое для расщепления ДНК с помощью YeeF-CT, не содержащий металлов YeeF-CT с добавлением 10 мкМ MnCl 2 инкубировали с плазмидной ДНК в диапазоне от 1 до 60 минут при 37 ° C.Для исследования оптимальной температуры для активности ДНКазы не содержащий металлов YeeF-CT с добавлением 10 мкМ MnCl 2 инкубировали с плазмидной ДНК при 4, 22, 37 и 55°C в течение 30 мин. Точно так же YeeF-CT (2 мкМ) подвергали диализу в буферах с различными уровнями pH (4,5–9,0) и различными концентрациями NaCl (0–550 мМ) в течение 12 часов. Диализованный белок инкубировали с плазмидной ДНК в течение 30 мин при 37°С. Образцы во всех приведенных выше экспериментах разделяли на 1% агарозный гель и визуализировали в УФ-свете.

Конфокальная микроскопия изображений

Клетки

Escherichia coli BL21 (DE3), экспрессирующие YeeF-CT, YeeF-CT (M) , YeeF-CT/YezG и pBADMyc-His A_Modi (отрицательный контроль), использовали для конфокальной микроскопии. Клетки выращивали и индуцировали, как указано в разделе «Кривая роста и подсчет КОЕ». Для конфокальной микроскопии образцы дважды промывали в 1 × PBS, а затем фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре. Образцы дважды промывали в 1×PBS, инкубировали с DAPI в течение 30 мин при 37°C, затем снова дважды промывали 1×PBS и, наконец, повторно суспендировали в 1×PBS и использовали для конфокальной микроскопии.Для конфокальной микроскопии 10 мкл каждого образца наносили на предметное стекло, покрытое 0,7% агарозой, накрывали покровным стеклом, сушили на воздухе и визуализировали с помощью конфокального микроскопа (Nikon A1R) с использованием 100-кратного масляного иммерсионного объектива и 1 апертура блока Airy. Образцы возбуждали с использованием длины волны возбуждения 405 нм.

Очистка белков

Клетки

Escherichia coli BL21 (DE3), экспрессирующие YeeF-CT/YeeF-CT (M) /YezG, высевали на чашки с агаром LB, содержащим специфические антибиотики, и инкубировали при 37°C в течение ночи.Одну колонию из чашки инокулировали в 5 мл среды LB для первичной культуры и инкубировали в течение ночи при постоянном встряхивании со скоростью 200 об/мин при 37°С. Для вторичной культуры инокулировали 1% первичной культуры, клетки индуцировали 0,1% L-арабинозы/0,3 мМ IPTG при 0,4–0,5 ОП 600 и далее инкубировали при 37°С в течение 2 ч при постоянном встряхивании 200 об/мин. Клетки осаждали центрифугированием при 6000g в течение 15 минут при 4°C и ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ HEPES, pH 7.5, 150 мМ NaCl и смесь ингибиторов протеазы без ЭДТА) с последующей обработкой ультразвуком. Супернатант собирали после центрифугирования при 18000 g в течение 45 мин. Все белки, меченные 6× His, очищали с использованием метода аффинной очистки на основе Ni-NTA в соответствии с инструкциями производителя. Фракции были дополнительно загружены и проверены на SDS-PAGE перед переходом к следующему этапу. Желаемые элюированные фракции объединяли и концентрировали с использованием центрифужных устройств для ультрафильтрации (Pall Corporation).Белки дополнительно очищали гель-фильтрационной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare). Идентичность образцов белка подтверждали с помощью масс-спектрометрии, а чистоту проверяли с помощью SDS-PAGE.

Аналитическое ультрацентрифугирование (AUC)

Для определения олигомерного состояния YeeF-CT (M) и YezG и стехиометрии их связывания были проведены эксперименты с AUC с использованием аналитической ультрацентрифуги Beckman-Coulter XL-A, оснащенной ротором TiAn50 с восемью отверстиями.Эксперименты по скорости осаждения проводились с использованием двухканальной центральной части из эпона (12 мм) и кварцевого окна. Образцы белка исследовали при трех различных концентрациях (8, 16 и 32 мкМ) в буфере 20 мМ HEPES, pH 7,5 и 150 мМ NaCl, и сканирование поглощения регистрировали при 220, 260 и 280 нм с интервалом в 3 минуты при 40 000 об/мин. при 25°С. Для изучения стехиометрии связывания комплекса YeeF-CT (M) /YezG очищенные белки смешивали (в различных молярных соотношениях, как указано в разделе «Результаты») и инкубировали при 4°C в течение 1 ч перед проведением аналитического ультрацентрифугирования (AUC ) эксперименты.Данные были подобраны с использованием SEDFIT (Schuck et al., 2002) для непрерывного распределения c(s). SEDNTERP (Laue et al., 1992) использовали для расчета плотности растворителя (ρ) и вязкости (η) по химическому составу различных компонентов буфера.

Изотермическая титрационная калориметрия (ITC)

Для определения K D , стехиометрии и термодинамики связывания YeeF-CT (M) /YezG были проведены эксперименты ITC с использованием MicroCal VP-ITC (GE Healthcare) при 25°C.Оба очищенных белка подвергали диализу с использованием диализной мембраны с MWCO 3500 против буфера (20 мМ HEPES, pH 7,5, 150 мМ NaCl). Перед экспериментами образцы дегазировали с помощью MicroCal ThermoVac (GE Healthcare). YeeF-CT (M) (10 мкМ; ячейка для образца) титровали YezG (300 мкМ; шприц) при постоянной скорости перемешивания 307 об/мин. Референтная мощность и объем впрыска поддерживались на уровне 5 мккал/сек и 6 мкл соответственно. Поскольку YeeF-CT (M) является димером согласно результатам AUC, для анализа белок-белковых взаимодействий использовали две модели сайтов связывания.Изотермы связывания подходили для определения кажущейся молярной энтальпии реакции (Δ H ), кажущейся энтропии ( S ), константы диссоциации ( K D ) и стехиометрии связывания ( N ). Для расчета теплоты разбавления лиганда эксперименты проводили в тех же экспериментальных условиях, за исключением того, что белок в ячейке с образцом заменяли буфером. Во всех расчетах из данных вычиталась теплота растворения лиганда. Данные были проанализированы с помощью Origin 6.0 пакет программ.

Биослойная интерферометрия (BLI)

Для изучения взаимодействия YeeF-CT (M) с ДНК, ForteBio Octet RED 96 (Forte Bio, Фремонт, Калифорния, США) и сенсорами, покрытыми стрептавидином (SA) (Forte Bio, Фремонт, Калифорния, США). ) были использованы. Эксперимент проводили при 25°C в 20 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl в качестве буфера для анализа, синтезировали 30-мерную 5′-биотинилированную ДНК (5′-AGC ACAATTTAACACTTTTGTCAAGCGGCC-3′) и отжигали с комплементарной ДНК в буфере для отжига ( 20 мМ Трис рН 8.0, 50 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА). Перед использованием наконечники датчиков SA гидратировали в буфере для анализа в течение 15 минут. Лунки в 96-микролуночном планшете заполняли 200 мкл либо буфера, либо образца в каждом случае и встряхивали при 1000 об/мин. Биотинилированную двухцепочечную ДНК размером 0,6 нм иммобилизовали на гидратированных наконечниках сенсора (рабочий и эталонный). Другой эталонный сенсор без биотинилированной двухцепочечной ДНК подвергают той же процедуре двойного реферирования для вычитания неспецифического связывания белка с сенсорами, покрытыми стрептавидином.После иммобилизации с биотинилированной ДНК проводили связывающее взаимодействие с различными концентрациями (0,25–2 мкМ) YeeF-CT (M) , которое включало базовый уровень (120 с), ассоциацию (300 с), диссоциацию (600 с), регенерация с 10 мМ NaOH и (30 с) базовая линия (120 с). Для измерения кинетики связывания YeeF-CT (M) с ДНК кончик сенсора, иммобилизованный с ДНК, сначала перемещали в лунку, содержащую буфер для анализа с YeeF-CT (M) , для изучения ассоциации, а затем перемещали хорошо, имея только буфер для анализа для изучения диссоциации.K D рассчитывали с использованием модели подбора кривой (1:1) с использованием программного обеспечения ForteBio Data Analysis 9.0.

Анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA)

Для анализа связывания ДНК in vitro были проведены анализы изменения электрофоретической подвижности. Различные концентрации YeeF-CT (M) и YeeF-CT (M) /YezG (12,5–50 мкМ) смешивали с 50 и 80 нг двухцепочечной ДНК (продукт ПЦР-амплификации) в буфере (20 мМ HEPES pH 7,5). , 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин.Образцы разделяли на 1% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали с помощью системы гель-документации (Syngene, США).

Результаты

Экспрессия YeeF-CT токсична для роста бактерий, а коэкспрессия YezG может нейтрализовать токсический эффект

Для функциональной характеристики токсина YeeF-CT мы трансформировали плазмиду pBADMyc-His A-Modi- yeeF-CT в компетентные клетки E. coli BL21(DE3). Внеклеточный экспорт полиморфных токсинов опосредуется двухкомпонентной системой секреции у грамотрицательных бактерий и системой секреции типа VII у грамположительных бактерий.N-концевой домен в CDI и токсинах контактно-зависимого антагонизма играет решающую роль в секреции токсина (Aoki et al., 2005; Whitney et al., 2017). Однако для проверки токсичности YeeF-CT на гетерологичном хозяине, E. coli , N-концевой домен не был включен в конструкцию. Родственные белки иммунитета, с другой стороны, являются цитозольными белками, поскольку их основная роль заключается в защите клеток-хозяев от аутоингибирования (Aoki et al., 2005; Whitney et al., 2017). Итак, мы использовали нативный полноразмерный YezG для исследований коэкспрессии и нейтрализации.Экспрессию YeeF-CT индуцировали 0,1% L-арабинозой. Результаты кривой роста показывают, что индукция YeeF-CT ингибирует рост E. coli по сравнению как с неиндуцированными клетками, так и с клетками, несущими пустой вектор (отрицательный контроль) (рис. 2А). Экспрессия белка была подтверждена анализом SDS-PAGE (рис. 2А, вставка). Чтобы исследовать защитную роль YezG, мы совместно трансформировали pET28a- yezG и pBADMyc-His A_Modi- yeeF-CT для совместной экспрессии как YezG, так и YeeF-CT соответственно.Клетки, совместно экспрессирующие YeeF-CT и YezG, имели профиль кривой роста, аналогичный контрольным клеткам (рис. 2А), что указывает на то, что коэкспрессия YezG защищает от токсичности, опосредованной YeeF-CT. Гистидин является каталитически важным остатком в нескольких нуклеазах (Ho et al., 2000). Множественное выравнивание последовательностей YeeF-CT с гомологами других бактерий предполагает, что His581 является высококонсервативным (дополнительная фигура S1). Итак, мы мутировали остаток His581 в аланин, чтобы проверить его потенциальную роль в активности, и сконструировали точечный вариант YeeF-CT (M) .Экспрессия YeeF-CT (M) была подтверждена анализом SDS-PAGE (рис. 2А, вставка). Анализ кривой роста показывает, что экспрессия YeeF-CT (M) не оказывала видимого влияния на рост E. coli (рис. 2А).

Рисунок 2. Влияние экспрессии YeeF-CT на рост и морфологию бактерий. (A) Анализ кривой роста проводили в клетках, экспрессирующих YeeF-CT, YeeF-CT (M) и YeeF-CT/YezG, и отрицательном контроле.Клетки, экспрессирующие YeeF-CT, демонстрируют снижение OD 600 , тогда как экспрессия YeeF-CT (M) , YeeF-CT/YezG и отрицательного контроля не влияла на рост клеток. На вставке показан анализ SDS-PAGE, показывающий экспрессию белков; (1) Белковая лестница; (2) отрицательный контроль; 3 – ЙиФ-КТ; (4) YeeF-CT (М) и; (5) YeeF-CT/YezG. Поскольку молекулярная масса YeeF-CT и YezG, по-видимому, одинакова, то есть 18,9 и 19,2 кДа соответственно, они появились в виде одной полосы. (B) Анализ подсчета КОЕ также хорошо коррелирует с анализом кривой роста. (C) TEM-визуализация клеток, содержащих только плазмиду (верхняя панель), экспрессирующих YeeF-CT (вторая панель), YeeF-CT (M) (третья панель) и YeeF-CT/YezG (нижняя панель). В то время как клетки, визуализированные через 0 минут, демонстрируют гладкую поверхность во всех образцах, через 30 минут после индукции клетки, экспрессирующие YeeF-CT, по-видимому, имеют некоторые дефекты на поверхности, которые становятся совершенно очевидными через 60 и 120 минут после индукции. Синяя стрелка показывает удлинение клетки, а черная стрелка показывает дефект клеточной поверхности. Клетки, экспрессирующие YeeF-CT (M) и YeeF-CT/YezG, имели гладкую поверхность и интактную клеточную стенку во все моменты времени.

Хотя анализ кривой роста на основе оптической плотности предполагает, что экспрессия YeeF-CT вызывает остановку роста, мы также хотели определить влияние экспрессии YeeF-CT на жизнеспособность клеток. Мы провели анализ колониеобразующих единиц (КОЕ) для изучения жизнеспособности клеток. Данные свидетельствуют о том, что экспрессия YeeF-CT привела к снижению КОЕ через 1 час после индукции (рис. 2В). Количество КОЕ в клетках отрицательного контроля, клетках, экспрессирующих YeeF-CT (M) , и клетках, совместно экспрессирующих YeeF-CT и YezG, не показало снижения жизнеспособности клеток (фиг. 2B).Снижение количества КОЕ предполагает, что экспрессия YeeF-CT является бактерицидной (рис. 2В). Мы не заметили каких-либо заметных изменений кривых роста в первые часы после индукции, но наблюдалось снижение количества КОЕ в клетках, экспрессирующих YeeF-CT. Измерения на основе OD не отличают живые от мертвых клеток, поэтому эксперименты на основе КОЕ имели решающее значение для изучения эффекта экспрессии токсина. Кроме того, нас интересовало исследование влияния экспрессии YeeF-CT на морфологию клеток.Поэтому мы использовали просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ), чтобы визуализировать влияние экспрессии YeeF-CT на клеточную морфологию. ПЭМ-изображение клеток, экспрессирующих YeeF-CT, YeeF-CT (M) , YeeF-CT/YezG, и клеток, содержащих отрицательный контроль, выполняли в четырех временных точках, т.е. через 0, 30, 60 и 120 минут после индукции. (Рисунок 2С). В начальные моменты времени все клетки имели нормальную палочковидную морфологию с интактной клеточной мембраной. Токсическое действие YeeF-CT привело к грубым морфологическим дефектам, на что указывают неровные клеточные поверхности, разрыв мембраны и удлинение клеток (рис. 2C).Интересно, что клетки, экспрессирующие YeeF-CT (M) , YeeF-CT/YezG и несущие вектор, демонстрируют только интактные клетки с типичной палочковидной морфологией во все моменты времени, протестированные в текущем исследовании. С увеличением времени наблюдаются выраженные различия в морфологических особенностях клеток, экспрессирующих YeeF-CT, по сравнению с клетками, экспрессирующими YeeF-CT (M) и пару YeeF-CT/YezG токсин/иммунитет. Вместе эти результаты подтвердили, что экспрессия YeeF-CT токсична для клеток и вызывает наблюдаемые морфологические изменения.Кроме того, YeeF-CT и YezG составляют функциональную пару токсин/иммунитет, тем самым демонстрируя потенциальную роль YezG в защите клеток-ингибиторов от аутоингибирования.

YeeF-CT является неспецифической ДНКазой и расщепляет ДНК как в

in vitro , так и в in vivo Условия

Чтобы понять молекулярную основу токсичности, вызываемой YeeF-CT в клетках-мишенях, мы попытались идентифицировать молекулярную мишень(и) токсина YeeF-CT. YeeF-CT является предполагаемой неспецифической ДНК/РНК-эндонуклеазой, поэтому мы исследовали активность ДНКазы и РНКазы.Для идентификации молекулярной мишени мы выделили геномную ДНК (гДНК) и тотальную РНК из клеток, экспрессирующих YeeF-CT. Мы могли четко наблюдать смазывание ДНК в клетках, сверхэкспрессирующих YeeF-CT, в то время как профили гДНК образцов до индукции и отрицательного контроля были схожими (рис. 3А). Эти данные свидетельствуют о том, что YeeF-CT расщепляет ДНК (рис. 3А). Не было заметных изменений в профилях UREA-PAGE, извлеченных из общей РНК, для всех образцов, что свидетельствует о том, что YeeF-CT не расщепляет РНК (дополнительная фигура S2).Профиль гДНК образцов, экспрессирующих как YeeF-CT, так и YezG, показывает профиль гДНК, аналогичный отрицательному контролю, что свидетельствует о защитной роли YezG в опосредованной YeeF-CT токсичности (рис. 3А). Чтобы выяснить, является ли расщепление ДНК при токсичности, вызванной YeeF-CT, следствием прямой активности YeeF-CT, мы провели анализов расщепления ДНК in vitro с использованием суперскрученной плазмидной ДНК в качестве субстратов. YeeF-CT был способен разлагать суперскрученную плазмиду в зависимости от концентрации (рис. 3В).Чтобы исследовать защитную роль YezG in vitro , мы сначала инкубировали YeeF-CT с возрастающими концентрациями YezG при комнатной температуре в течение 45 минут, а затем смешали этот предварительно сформированный комплекс с ДНК. Результаты показывают, что YezG способен защищать деградацию ДНК в зависимости от концентрации (рис. 3C), что еще раз указывает на роль белка иммунитета YezG как прямого ингибитора активности ДНКазы YeeF-CT. Очищенный YeeF-CT (M) не показал расщепления плазмидной ДНК (рис. 3D).

Рисунок 3. In vitro и in vivo характеристика молекулярной мишени YeeF-CT. (A) Электрофорез геномной ДНК, выделенной из клеток, несущих только плазмиду, экспрессирующих YeeF-CT, YeeF-CT (M) и YeeF-CT/YezG через 0 и 60 мин после индукции. В панели A ; 1, 2, 3, 4 представляют собой клетки, несущие только плазмиду, клетки, экспрессирующие YeeF-CT, клетки, экспрессирующие YeeF-CT (M) , клетки, экспрессирующие YeeF-CT/YezG, соответственно. (B) Электрофорез в агарозном геле, показывающий деградацию плазмидной ДНК при различных концентрациях очищенного YeeF-CT. (C) Электрофорез в агарозном геле, показывающий защитную роль YezG при инкубации плазмидной ДНК с фиксированной концентрацией YeeF-CT и возрастающей концентрацией YezG. (D) Инкубация YeeF-CT (M) с плазмидной ДНК показала потерю активности ДНКазы. (E) Конфокальные микроскопические изображения окрашенного DAPI E.coli , экспрессирующие YeeF-CT, YeeF-CT (M) и YeeF-CT/YezG, демонстрирующие повреждение ДНК через 4 часа после индукции YeeF-CT 0,1% L-арабинозы. (F) Гистограммы представляют среднюю интенсивность флуоресценции через 0 и 4 часа после индукции YeeF-CT, YeeF-CT (M) , YeeF-CT и YezG и отрицательного контроля. (G) Электрофорез плазмидной ДНК в агарозном геле, инкубированной с фиксированной концентрацией YeeF-CT и фиксированной концентрацией различных ионов металлов.

Мы провели эксперименты с конфокальной микроскопией для дальнейшего изучения активности ДНКазы in vivo YeeF-CT. Клетки окрашивали с использованием окрашивания DAPI. Клетки, трансформированные pBADMyc-His A_Modi (отрицательный контроль), pBADMyc-His A_Modi- yeeF -CT (активный токсин), pBADMyc-His A_Modi- yeeF -CT (M) (неактивный токсин), pBADMyc-His A_Modi- yeeF -CT/pET28a- yezG (коэкспрессия токсина и белка иммунитета) индуцировали добавлением соответствующего индуктора.Клетки отрицательного контроля, клетки, экспрессирующие YeeF-CT (M) , и YeeF-CT/YezG демонстрировали однородное окрашивание ДНК, указывающее на интактную ДНК до индукции и через 4 часа после индукции, в то время как сигнал флуоресценции был сильно снижен в клетках, экспрессирующих активный токсин, что свидетельствует о обширная деградация ДНК (рис. 3E). Количественный анализ сигналов флуоресценции также предполагает снижение сигналов флуоресценции, полученных от клеток, экспрессирующих YeeF-CT (рис. 3F). Эти результаты показывают, что экспрессия YeeF-CT вызывает токсичность за счет деградации гДНК клеток, которая может быть устранена экспрессией YezG.Кроме того, эти исследования дополнительно подтверждают роль высококонсервативного остатка His581 в ДНКазной активности YeeF-CT.

YeeF-CT представляет собой металлозависимую ДНКазу

Чтобы выяснить, является ли YeeF-CT металлозависимой ДНКазой, мы получили апо-YeeF-CT путем хелатирования ионов металлов из очищенного белка с 10 мМ ЭДТА. Результат предполагает, что апо-YeeF-CT не проявляет никакой активности ДНКазы (рис. 3G), что указывает на то, что YeeF-CT является металлозависимой ДНКазой. Однако имело место размытие вверх, вероятно, из-за образования комплекса YeeF-CT: ДНК.Чтобы идентифицировать ионы металлов, ответственные за активность ДНКазы, мы инкубировали апо-YeeF-CT с концентрацией 10 мкМ различных ионов щелочных, земельных и переходных двухвалентных металлов. Электрофорез в агарозном геле показывает, что в зависимости от добавленного иона металла наблюдалась различная степень расщепления ДНК. YeeF-CT продемонстрировал надежное расщепление ДНК с Mn 2+ при физиологической концентрации 10 мкМ (Anjem et al., 2009; Kaur et al., 2014). Внутриклеточная концентрация Mg 2+ находится в диапазоне мМ (Cayley et al., 1991), поэтому мы также проверили активность в присутствии 10 мМ Mg 2+ , каталитическая активность была эквивалентна активности, наблюдаемой для Mn 2+ . Для дальнейшей биохимической характеристики YeeF-CT мы исследовали его ДНКазную активность в разное время, при другой температуре, другом уровне pH и разных концентрациях соли, используя очищенную плазмиду в качестве субстрата. Наши данные показывают, что YeeF-CT демонстрирует зависящее от времени расщепление ДНК-субстрата (дополнительная фигура S3A). Фермент проявлял активность в широком диапазоне температур (от 4 до 55°C, испытанные в этом исследовании), с максимальной активностью при 37°C.При 4 ° C мы могли наблюдать популяцию релаксированной ДНК с разрывами, что свидетельствует о активности никазы (дополнительная фигура S3B). Фермент активен в основном диапазоне pH и концентрации NaCl до 250 мМ (дополнительные рисунки S3C, D).

YeeF-CT существует в виде гомодимера в растворе и взаимодействует с мономерным YezG с константой диссоциации наномолярного диапазона

Олигомерное состояние играет важную роль в функционировании белка. Мы использовали аналитическое ультрацентрифугирование (AUC) для изучения олигомерных состояний и стехиометрии связывания YeeF-CT и YezG.Эксперименты с AUC проводили при трех различных концентрациях обоих очищенных белков при 25°C. Анализ скорости осаждения очищенных YeeF-CT и YezG выявил основную популяцию 2,6 и 2,1 S соответственно. Предполагая, что YeeF-CT представляет собой гомодимер в диапазоне протестированных концентраций (рис. 4A), а YezG откладывается в виде мономера (рис. 4B). Кроме того, в обоих белках наблюдалось образование зависимых от концентрации олигомеров более высокого порядка в виде незначительной популяции (∼3–5%). Чтобы определить стехиометрию связывания комплекса, концентрацию YeeF-CT фиксировали и титровали увеличивающимися концентрациями YezG.Одиночный пик, соответствующий 3,4 S, наблюдали, когда 7,5 мкМ YeeF-CT (концентрация димера) смешивали с 15 мкМ YezG (концентрация мономера), что указывает на то, что димерная молекула токсина связывается с двумя мономерными молекулами белка иммунитета. (Рисунок 4С). Подробные параметры, полученные в результате экспериментов с AUC, перечислены в дополнительной таблице S2. Для дальнейшей характеристики взаимодействий YeeF-CT и YezG мы использовали изотермическую титрационную калориметрию (ITC). Поскольку YeeF-CT представляет собой гомодимер, а YezG существует в виде мономера, мы использовали связывание с двумя сайтами, чтобы соответствовать данным ITC.Изотерма связывания показала четкий двухфазный профиль связывания, предполагающий кооперативность белок-белковых взаимодействий. Данные ITC предполагают, что два сайта связывания в YeeF-CT имеют разную аффинность K D 1 = 29,4 ± 4,7 и K D 2 = 91,7 ± 7,3 нМ для YezG (рис. 4D). Поскольку YeeF-CT является гомодимером, следовательно, существует два потенциальных сайта связывания YezG, и связывание первой молекулы YezG аллостерически влияет на связывание другой молекулы.Все термодинамические параметры приведены в дополнительной таблице S3.

Рисунок 4. Олигомерное состояние и кинетика связывания YeeF-CT, YezG и их взаимодействия. Распределение коэффициента седиментации (ы) YeeF-CT, YezG и YeeF-CT/YezG показано на панелях A-C соответственно. (A,B) YeeF-CT и YezG существуют преимущественно в виде гомодимера и мономера в растворе соответственно. (C) YeeF-CT/YezG связывают с образованием в растворе гетеротетрамера.Пик I и II соответствуют избытку YezG и YeeF-CT соответственно. Пик III соответствует комплексу YeeF-CT/YezG. Во всех образцах белка также наблюдается незначительная популяция олигомеров более высокого порядка, зависящая от концентрации. (D) Репрезентативный профиль изотермы взаимодействий YeeF-CT и YezG. Верхняя панель представляет калориметрическое титрование, а нижняя панель представляет производную изотерму связывания, построенную в зависимости от молярного отношения YezG.

YeeF-CT/YezG/ДНК образует стабильный тройной комплекс: YezG является экзосайтным ингибитором YeeF-CT

Используя YeeF-CT (M) , мутант активного сайта YeeF-CT, мы провели анализ сдвига электрофоретической подвижности, чтобы исследовать его свойство связывания ДНК.Мы наблюдали замедление подвижности ДНК, вызванное связыванием YeeF-CT (M) в зависимости от концентрации (рис. 5А). При увеличении концентрации YeeF-CT (M) комплекс ДНК/белок не мог мигрировать из лунок. Мы дополнительно подтвердили свойство связывания ДНК YeeF-CT с помощью экспериментов по интерферометрии BioLayer (BLI). ДНК была иммобилизована на сенсорном чипе SA. Сдвиги в сенсограммах наблюдались во время фазы ассоциации с YeeF-CT (M) (рис. 5B).Мы также исследовали свойство связывания ДНК YeeF-CT (M) в присутствии YezG, чтобы увидеть, ингибирует ли связывание YezG связывание субстрата. Интересно, что предварительно сформированный комплекс YeeF-CT/YezG сохранил способность связываться с ДНК, предполагая, что сайт связывания ДНК на YeeF-CT не маскирует связывание YezG (рис. 5C). При добавлении различных концентраций предварительно сформированного комплекса YeeF-CT/YezG мы могли наблюдать сдвиг в сенсограммах, предполагающий, что комплекс сохраняет способность связывать ДНК (рис. 5D).YeeF-CT является неспецифической ДНКазой, поэтому стехиометрию YeeF-CT (M) : фрагмента ДНК, используемого в исследовании, трудно интерпретировать в соответствии с проведенными экспериментами. Результаты BLI хорошо согласуются с исследованиями EMSA. Вместе эти результаты показывают, что YeeF-CT сохраняет свойство связывания ДНК как в свободном, так и в связанном с YezG состоянии. Другими словами, YezG и/или ДНК связываются с неперекрывающимися сайтами YeeF-CT. Таким образом, YezG действует как экзосайт-ингибитор активности YeeF-CT.

Рисунок 5. Связывание ДНК YeeF-CT (M) и YeeF-CT (M) /YezG. (A) YeeF-CT (M) проявляет свойство неспецифического связывания ДНК. Мазок замедленной ДНК можно визуализировать в агарозном геле. С увеличением концентрации YeeF-CT (M) подвижность ДНК-белкового комплекса замедляется и застревает в лунке. (B) Кинетика BLI, показывающая связывание неспецифической двухцепочечной ДНК с YeeF-CT (M) . (C, D) Связывание YezG не изменяет свойства связывания ДНК YeeF-CT (M) . (C) Электрофорез ДНК в агарозном геле, инкубированный с различными концентрациями YeeF-CT (M) /YezG, показывает замедление подвижности ДНК. (D) Кинетика BLI, показывающая связывание неспецифической двухцепочечной ДНК с YeeF-CT (M) /YezG. На рисунке показаны как необработанные сенсограммы (черные линии), так и аппроксимированные кривые (красные линии).

Обсуждение

Микробы всегда находятся под постоянной угрозой со стороны соседних микробов-конкурентов за ограниченные ресурсы и пространство (Hibbing et al., 2010). Недавний отчет продемонстрировал, что члены семейства полиморфных токсинов LXG участвуют в контактно-зависимом антагонизме роста, который может играть важную роль в межбактериальной конкуренции (Whitney et al., 2017). В настоящем исследовании мы провели подробное исследование YeeF-CT/YezG, члена семейства полиморфных токсинов LXG, из B. subtilis subsp. Спизизении ул. W23 . Наши результаты показывают, что гетерологичная экспрессия YeeF-CT ингибирует рост клеток, который может быть заблокирован экспрессией YezG, родственного белка иммунитета.Цитотоксичность YeeF-CT может быть связана с его неспецифической ДНКазной активностью, нацеленной на хромосомную ДНК, которая, вероятно, не поддается восстановлению с помощью механизмов репарации ДНК. Хотя предполагается, что полиморфные токсины нацелены на широкий спектр молекулярных мишеней (Zhang et al., 2011, 2012; Holberger et al., 2012), большинство экспериментально охарактеризованных полиморфных токсинов обладают нуклеазной активностью, направленной либо на ДНК, либо на РНК (Aoki et al. ., 2010; Diner et al., 2012; Morse et al., 2012; Jamet and Nassif, 2015; Johnson et al., 2016б; Огир и др., 2016). Полиморфные токсины принадлежат к разным суперсемействам, например, токсин CdiA-CT ECL из Enterobacter cloacae ATCC 13047 и CdiA-CT EC536 из уропатогенного E. coli 536 являются членами семейств Ntox21 и Ntox2 super, соответственно ( Джонсон и др., 2016а, б). Эти токсины различаются по субстратной специфичности, и большинство из них являются Mg 2+ и/или Zn 2+ зависимыми нуклеазами (Morse et al., 2012; Johnson et al., 2016a, b), за исключением CdiA-CT Ykris из Y. kristensenii ATCC 33638, которая является металл-независимой нуклеазой (Batot et al., 2017). Полиморфные токсины используют только один ион металла для своей нуклеазной активности (Morse et al., 2012; Johnson et al., 2016a, b), за исключением CdiA-CT EC869 , который использует Mg 2+ для никазной активности и Zn 2+ для ДНКазной активности (Morse et al., 2012). В предыдущем исследовании члены семейства PF04740 выявили РНКазную активность в доменах YobL-CT, YxiD-CT и YqcG-CT из B.subtilis 168 (Holberger et al., 2012). Однако YeeF-CT из B. subtilis 168 не был функционально охарактеризован. В этом исследовании мы показываем, что YeeF-CT является металлозависимой ДНКазой и для ее активности требуются ионы Mg 2+ или Mn 2+ . Дальнейшая биохимическая характеристика YeeF-CT предполагает, что этот фермент активен в различных условиях, таких как повышенная температура, щелочной рН и низкий уровень соли. Таким образом, представленные здесь данные добавляют ДНК к списку молекулярных мишеней токсинов семейства PF04740, и, следовательно, это семейство токсинов можно в широком смысле классифицировать как нуклеазы, обладающие либо РНКазной, либо ДНКазной активностью.

В этом исследовании мы демонстрируем, что ДНК/YeeF-CT/YezG может образовывать тройной комплекс, указывающий на то, что сайты связывания субстрата и сайты связывания белков иммунитета пространственно совершенно различны. Этот вид белков иммунитета называют «экзосайтными» ингибиторами ферментов (Kleanthous and Walker, 2001). Экзосайт является вторичным сайтом связывания, удаленным от активного сайта, присутствующего во многих ферментах (Kleanthous and Walker, 2001). Этот способ ингибирования также присутствует в комплексе CdiA-CT или 11 EC869 /CdiI токсин-иммунный комплекс из E.coli O157:H7 (Morse et al., 2012) и колицин (E3, 7, 8, 9), где они используют экзосайт и опосредованно нейтрализуют токсины, искажая активный центр и предотвращая связывание субстрата (Ko et al. , 1999; Mosbahi et al., 2004; Lancaster et al., 2008; Meenan et al., 2010). Однако нет сообщений о том, что комплекс токсин/иммунитет также взаимодействует с ДНК-субстратом. Пространственное исключение сайтов связывания белка иммунитета и субстрата, вероятно, предоставляет новые возможности для развития новых интерфейсов взаимодействия белок-белок при сохранении целостности активного сайта и, следовательно, токсической активности.Это обеспечивает селективное преимущество перед соседними бактериями, имеющими близкородственные токсины.

Используя эксперименты с AUC, мы можем однозначно определить олигомерные состояния YeeF-CT и YezG и стехиометрию связывания комплекса. Насколько нам известно, это первый полиморфный токсин, который существует в виде гомодимера в растворе. До сих пор неясно, необходима ли димеризация для образования активного центра на границе раздела, повышает ли стабильность или участвует в какой-то другой функции.Будущие структурные исследования могут помочь нам лучше понять это. Олигомерное состояние YeeF-CT и YeeF-CT/YezG уникально среди структурно охарактеризованных пар токсин/иммунитет из других PTS (Morse et al., 2012, 2015; Johnson et al., 2016a, b). Для дальнейшего исследования термодинамических параметров этого взаимодействия мы использовали ИТК. Сродство YeeF-CT/YezG к наномолярному диапазону сравнимо с другими PTS, CdiA-CT 536 /CdiI 536 (K D = 26,4 ± 2,1 нМ) (Kaundal et al., 2016), CDIA-CT II BP1026B / CDII II BP1026B (K D = 21,1 ± 9 нм) и CDIA- CTO 11 EC869 / CDII EC869 ( K D = 17,8 ± 7 нМ) (Morse et al., 2012) исследования грамотрицательных бактерий. Данные ITC предполагают аллостерический способ связывания, поскольку два сайта на димере YeeF-CT имеют ~3,5-кратную разницу в сродстве к молекулам YezG. Это предполагает, что связывание одной молекулы YezG, вероятно, может привести к последующим конформационным перестройкам, аллостерически снижающим сродство ко второй молекуле.Подводя итог, мы обнаружили зависимую от ионов металла бактериальную ДНКазу. Наши данные также свидетельствуют о том, что YezG является ингибитором экзосайта YeeF-CT, где предварительно сформированный комплекс токсин/иммунитет сохраняет способность связываться с ДНК-субстратом (рис. 5). Наша лаборатория в настоящее время работает над решением структур высокого разрешения комплексов YeeF-CT/YezG, YeeF-CT/YezG/ДНК и YeeF-CT/ДНК, чтобы лучше понять молекулярную основу для связывания ДНК и раскрыть аллостерический механизм, связанный с токсином. /взаимодействия белков иммунитета.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Вклад авторов

КТ задумал идею. KT, SK и AD спланировали эксперименты, проанализировали данные и написали рукопись. С.К., А.Д. и Г.К. проводили эксперименты.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Совета по научным и промышленным исследованиям и Департамента науки и технологий Индии, гранты KT.KT был лауреатом премии «Молодой инновационный биотехнолог» 2011 года, Департамент биотехнологии, Индия. SK был получателем стипендии старшего научного сотрудника UGC. AD был получателем старшей научной стипендии DBT. GK был сотрудником DST-INSPIRE.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

KT и SK хотели бы поблагодарить Deepak Bhatt, Vineet Kumar и Prashant Singh, CSIR-IMTECH за их ценную помощь в конфокальной микроскопии и экспериментах BLI.Мы также благодарим г-на Химаншу Малхотра и г-на Рандипа за их помощь в экспериментах с ТЕМ. Авторы благодарят г-н Суриндер Сингх за его техническую поддержку и помощь.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.00095/full#supplementary-material

.

Ссылки

Анджем, А., Варгезе, С., и Имлей, Дж. А. (2009). Импорт марганца является ключевым элементом реакции OxyR на перекись водорода в Escherichia coli . Мол. микробиол. 72, 844–858. doi: 10.1111/j.1365-2958.2009.06699.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Аоки, С.К., Дайнер, Э.Дж., де Руденбеке, С.Т., Берджесс, Б.Р., Пул, С.Дж., Браатен, Б.А., и соавт. (2010). Широко распространенное семейство полиморфных контактно-зависимых систем доставки токсинов у бактерий. Природа 468, 439–442. doi: 10.1038/nature09490

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Аоки, С.К., Памма Р., Херндей А. Д., Бикхэм Дж. Э., Браатен Б. А. и Лоу Д. А. (2005). Контактно-зависимое ингибирование роста Escherichia coli . Наука 309, 1245–1248. doi: 10.1126/наука.1115109

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Batot, G., Michalska, K., Ekberg, G., Irimpan, E.M., Joachimiak, G., Jedrzejczak, R., et al. (2017). Токсин CDI Yersinia kristensenii является новым бактериальным членом суперсемейства РНКазы А. Рез. нуклеиновых кислот. 45, 5013–5025. doi: 10.1093/nar/gkx230

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кейли С., Льюис Б.А., Гуттман Х.Дж. и Рекорд М.Т. мл. (1991). Характеристика цитоплазмы Escherichia coli К-12 в зависимости от внешней осмолярности. Последствия для взаимодействия белок-ДНК in vivo. Дж. Мол. биол. 222, 281–300. дои: 10.1016/0022-2836(91)-о

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дайнер, Э.Дж., Бек, К.М., Уэбб, Дж.С., Лоу, Д.А., и Хейс, К.С. (2012). Идентификация пермиссивного фактора клетки-мишени, необходимого для контактно-зависимого ингибирования роста (CDI). Гены Дев. 26, 515–525. doi: 10.1101/gad.182345.111

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hayes, C.S., Koskiniemi, S., Ruhe, Z.C., Poole, S.J., and Low, D.A. (2014). Механизмы и биологическая роль контактно-зависимых систем торможения роста. Гавань Колд Спринг.Перспектива. Мед. 4:а010025. doi: 10.1101/cshperspect.a010025

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хиббинг, М.Е., Фукуа, К., Парсек, М.Р., и Петерсон, С.Б. (2010). Бактериальная конкуренция: выживание и процветание в микробных джунглях. Нац. Преподобный Микробиолог. 8, 15–25. doi: 10.1038/nrmicro2259

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хо Т. Ю., Ву С. Л., Сян С. Х., Чанг Т. Дж. и Сян С.Ю. (2000). Идентификация ДНК-связывающего домена и остатка активного сайта ДНКазы вируса псевдобешенства. Биохим. J. 346 (часть 2), 441–445. дои: 10.1042/bj3460441

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Холбергер, Л. Э., Гарса-Санчес, Ф., Ламуре, Дж., Лоу, Д. А., и Хейс, К. С. (2012). Новое семейство белков токсин/антитоксин у видов Bacillus . ФЭБС Письмо. 586, 132–136. doi: 10.1016/j.febslet.2011.12.020

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Жаме, А., Jousset, A.B., Euphrasie, D., Mukorako, P., Boucharlat, A., Ducousso, A., et al. (2015). Новое семейство секретируемых токсинов у патогенных видов Neisseria . PLoS Патог. 11:e1004592. doi: 10.1371/journal.ppat.1004592

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Jamet, A., Touchon, M., Ribeiro-Goncalves, B., Carrico, J.A., Charbit, A., Nassif, X., et al. (2017). Широко распространенное семейство полиморфных токсинов, кодируемых умеренными фагами. БМС Биол. 15:75. doi: 10.1186/s12915-017-0415-411

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Johnson, P.M., Beck, C.M., Morse, R.P., Garza-Sanchez, F., Low, D.A., Hayes, C.S., et al. (2016а). Раскрытие важной роли CysK в активации токсина CDI. Проц. Натл. акад. науч. США 113, 9792–9797. doi: 10.1073/pnas.1607112113

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джонсон, П. М., Gucinski, G.C., Garza-Sanchez, F., Wong, T., Hung, L.W., Hayes, C.S., et al. (2016б). Функциональное разнообразие комплексов цитотоксическая тРНКаза/иммунный белок из Burkholderia pseudomallei . Дж. Биол. хим. 291, 19387–19400. doi: 10.1074/jbc.M116.736074

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Каундал, С., Уттам, М., и Такур, К.Г. (2016). Двойная роль биосинтетического фермента CysK в контактно-зависимом ингибировании роста бактерий. PLoS One 11:e0159844. doi: 10.1371/journal.pone.0159844

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Каур Г., Сенгупта С., Кумар В., Кумари А., Гош А., Паррак П. и соавт. (2014). Новый MntR-независимый механизм гомеостаза марганца в Escherichia coli с помощью ассоциированного с рибосомой белка HflX. J. Бактериол. 196, 2587–2597. doi: 10.1128/JB.01717-1714

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ко, Т.П., Ляо, К.С., Ку, В.Ю., Чак, К.Ф., и Юань, Х.С. (1999). Кристаллическая структура ДНКазного домена колицина Е7 в комплексе с его ингибиторным белком Im7. Структура 7, 91–102. doi: 10.1016/s0969-2126(99)80012-4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Коскиниеми, С., Ламуре, Дж. Г., Николакакис, К. С., т’Кинт де Руденбеке, К., Каплан, М. Д., Лоу, Д. А., и соавт. (2013). Белки Rhs различных бактерий опосредуют межклеточную конкуренцию. Проц. Натл. акад. науч. США 110, 7032–7037. doi: 10.1073/pnas.1300627110

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ланкастер, Л. Э., Савелсберг, А., Клеантус, К., Винтермейер, В., и Роднина, М. В. (2008). Расщепление колицином Е3 16S рРНК ухудшает декодирование и ускоряет транслокацию тРНК на рибосомах Escherichia coli . Мол. микробиол. 69, 390–401. doi: 10.1111/j.1365-2958.2008.06283.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лауэ, Т.М., Шах Б.Д., Риджуэй Т.М. и Пеллетье С.Л. (1992). «Компьютерная интерпретация данных аналитического осаждения белков», в Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science , eds S.E. Harding, AJ Rowe и JC Horton, (Cambridge: Royal Society of Chemistry), 90–25.

Академия Google

Минан, Н. А., Шарма, А., Флейшман, С. Дж., Макдональд, С. Дж., Морел, Б., Бетцель, Р., и соавт. (2010). Структурно-энергетическая основа высокой селективности в высокоаффинном белок-белковом взаимодействии. Проц. Натл. акад. науч. США 107, 10080–10085. doi: 10.1073/pnas.06107

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Морс, Р.П., Николакакис, К.С., Уиллетт, Дж.Л., Геррик, Э., Лоу, Д.А., Хейс, К.С., и соавт. (2012). Структурные основы токсичности и иммунитета в системах контактно-зависимого торможения роста (ИКР). Проц. Натл. акад. науч. США 109, 21480–21485. doi: 10.1073/pnas.1216238110

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Морс, Р.P., Willett, J.L., Johnson, P.M., Zheng, J., Credali, A., Iniguez, A., et al. (2015). Диверсификация взаимодействий бета-аугментации между токсином CDI и белками иммунитета. Дж. Мол. биол. 427, 3766–3784. doi: 10.1016/j.jmb.2015.09.020

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мосбахи, К., Уокер, Д., Леа, Э., Мур, Г.Р., Джеймс, Р., и Клеантус, К. (2004). Дестабилизация эндонуклеазного домена колицина Е9 при взаимодействии с отрицательно заряженными фосфолипидами: последствия для транслокации колицина в бактерии. Дж. Биол. хим. 279, 22145–22151. doi: 10.1074/jbc.M400402200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ожье, Дж. К., Дювик, Б., Лануа, А., Живодан, А., и Годрио, С. (2016). Новый член растущего семейства контактно-зависимых систем ингибирования роста у Xenorhabdus doucetiae. PLoS One 11:e0167443. doi: 10.1371/journal.pone.0167443

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пул, С.Дж., Дайнер, Э.Дж., Аоки, С.К., Браатен, Б.А., т’Кинт де Руденбеке, К., Лоу, Д.А., и соавт. (2011). Идентификация функциональных генов токсина/иммунитета, связанных с системами контактно-зависимого ингибирования роста (CDI) и реаранжировки (Rhs). Генетика PLoS. 7:e1002217. doi: 10.1371/journal.pgen.1002217

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Schuck, P., Perugini, M.A., Gonzales, N.R., Howlett, G.J., and Schubert, D. (2002). Анализ распределения белков по размерам с помощью аналитического ультрацентрифугирования: стратегии и применение к модельным системам. Биофиз. Дж. 82, 1096–1111. doi: 10.1016/S0006-3495(02)75469-75466

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Уотерс, К.М., и Басслер, Б.Л. (2005). Чувство кворума: межклеточное общение у бактерий. год. Преподобная ячейка. Дев. биол. 21, 319–346. doi: 10.1146/annurev.cellbio.21.012704.131001

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Уитни, Дж. К., Петерсон, С. Б., Ким, Дж., Пазос, М., Верстер, А.J., Radey, M.C., et al. (2017). Широко распространенное семейство токсинов опосредует контактно-зависимый антагонизм между грамположительными бактериями. eLife 6:e26938. doi: 10.7554/eLife.26938

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан Д., де Соуза Р. Ф., Анантараман В., Айер Л. М. и Аравинд Л. (2012). Системы полиморфных токсинов: всесторонняя характеристика способов переноса, процессинга, механизмов действия, иммунитета и экологии с использованием сравнительной геномики. биол. Прямой. 7:18. дои: 10.1186/1745-6150-7-18

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан, Д., Айер, Л.М., и Аравинд, Л. (2011). Новая система иммунитета к бактериальным токсинам, разлагающим нуклеиновые кислоты, и их рекрутирование в различных эукариотических и ДНК-вирусных системах. Рез. нуклеиновых кислот. 39, 4532–4552. doi: 10.1093/nar/gkr036

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Анализ полиморфизма нуклеотидов для идентификации западноафриканской группы Bacillus anthracis: линия, лишенная антрозы | BMC Microbiology

  • Carlson CJ, Getz WM, Kausrud KL, Cizauskas CA, Blackburn JK, Bustos Carrillo FA, et al.Споры и почва с шести сторон: междисциплинарность и экологическая биология сибирской язвы (Bacillus anthracis). Biol Rev. 2018; 93:1813–31.

    Артикул Google ученый

  • Крачалик И., Малания Л., Броладзе М., Навдарашвили А., Имнадзе П., Райан С.Дж. и др. Изменение политики вакцинации скота меняет эпидемиологию сибирской язвы человека, Грузия, 2000–2013 гг. вакцина. 2017;35:6283–9.

    Артикул Google ученый

  • Крачалик И., Абдуллаев Р., Асадов К., Исмаилова Р., Багирова М., Устун Н. и др.Изменение моделей сибирской язвы человека в Азербайджане в постсоветский период и в эпоху превентивной вакцинации скота. PLoS Negl Trop Dis. 2014;8:e2985.

    Артикул Google ученый

  • Sylvestre P, Couture-Tosi E, Mock M. Коллагеноподобный поверхностный гликопротеин является структурным компонентом экзоспориума Bacillus anthracis . Мол микробиол. 2002; 45: 169–78.

    КАС Статья Google ученый

  • Сильвестр П., Кутюр-Тоси Э., Мок М.Полиморфизм в коллагеноподобной области белка Bacillus anthracis BclA приводит к изменению длины филамента экзоспория. J Бактериол. 2003; 185:1555–63.

    КАС Статья Google ученый

  • Bozue J, Moody KL, Cote CK, Stiles BG, Friedlander AM, Welkos SL, et al. Споры Bacillus anthracis мутанта bclA проявляют повышенную адгезию к эпителиальным клеткам, фибробластам и эндотелиальным клеткам, но не к макрофагам.Заразить иммун. 2007; 75: 4498–505.

    КАС Статья Google ученый

  • Daubenspeck JM, Zeng H, Chen P, Dong S, Steichen CT, Krishna NR, et al. Новые олигосахаридные боковые цепи коллагеноподобной области BclA, основного гликопротеина экзоспориума Bacillus anthracis . Дж. Биол. Хим. 2004; 279:30945–53.

    КАС Статья Google ученый

  • Werz DB, Seeberger PH.Полный синтез тетрасахарида антигена Bacillus anthracis – создание вакцины-кандидата против сибирской язвы. Angew Chem Int Ed Eng. 2005;44:6315–8.

    КАС Статья Google ученый

  • Тамборрини М., Верц Д.Б., Фрей Дж., Плюшке Г., Сибергер П.Х. Антиуглеводные антитела для обнаружения спор сибирской язвы. Angew Chem Int Ed Eng. 2006;45:6581–2.

    КАС Статья Google ученый

  • Kuehn A, Kovác P, Saksena R, Bannert N, Klee SR, Ranisch H, et al.Разработка антител против тетрасахарида антрозы для специфического обнаружения спор Bacillus anthracis . Клин Вакцина Иммунол. 2009;16:1728–37.

    КАС Статья Google ученый

  • Мехта А.С., Сайле Э., Чжун В., Бускас Т., Карлсон Р., Канненберг Э. и др. Синтез и антигенный анализ гликопротеинового олигосахарида BclA из экзоспориума Bacillus anthracis . Angew Chem Weinheim Bergstr. Ger.2006; 12:9136–49.

    КАС Google ученый

  • Де Рикко Р., Вентура С.Л., Карбони Ф., Саксена Р., Ковач П., Адамо Р. Связь структура-иммуногенность гликоформ α- и β-тетрасахаридов из Bacillus anthracis Exosporium и их фрагментов. Молекулы. 2018;23:E2079.

    Артикул Google ученый

  • Tamborrini M, Oberli MA, Werz DB, Schürch N, Frey J, Seeberger PH, et al.Иммуноопределение антрозосодержащего тетрасахарида в экзоспориуме штаммов Bacillus anthracis и Bacillus cereus . J Appl Microbiol. 2009; 106:1618–28.

    КАС Статья Google ученый

  • Донг С., Макферсон С.А., Ван Ю., Ли М., Ван П., Тернбоу С.Л. и др. Характеристика ферментов, кодируемых опероном биосинтеза антрозы Bacillus anthracis . J Бактериол. 2010;192:5053–62.

    КАС Статья Google ученый

  • Донг С., Макферсон С.А., Тан Л., Чеснокова О.Н., Тернбоу С.Л., Притчард Д.Г. Оперон биосинтеза антрозы Bacillus anthracis . J Бактериол. 2008; 190:2350–9.

    КАС Статья Google ученый

  • Tamborrini M, Bauer M, Bolz M, Maho A, Oberli MA, Werz DB, et al. Идентификация африканской линии Bacillus anthracis , в которой отсутствует экспрессия антрозосодержащего олигосахарида, ассоциированного с поверхностью спор.J Бактериол. 2011;193:3506–11.

    КАС Статья Google ученый

  • Блэкберн Дж.К., Одугбо М.О., Ван Эрт М., О’Ши Б., Маллинз Дж., Перретен В. и др. Разнообразие и географический потенциал Bacillus anthracis в Нигерии, Камеруне и Чаде: дальнейшая поддержка новой западноафриканской линии. PLoS Negl Trop Dis. 2015;9:e0003931.

    Артикул Google ученый

  • Листа Ф., Фаджони Г., Вальевац С., Чаммарукони А., Вайсэр Ж., Ле Дуже С. и др.Генотипирование штаммов Bacillus anthracis на основе автоматизированного анализа капиллярных 25-локусных множественных локусов с переменным числом тандемных повторов. БМС микробиол. 2006; 6:33.

    Артикул Google ученый

  • Maho A, Rossano A, Hächler H, Holzer A, Schelling E, Zinsstag J, et al. Чувствительность к антибиотикам и молекулярное разнообразие штаммов Bacillus anthracis в Чаде: обнаружение новой филогенетической подгруппы. Дж. Клин Микробиол.2006;44:3422–5.

    КАС Статья Google ученый

  • Пило П., Россано А., Бамамга Х., Абдулкадири С., Перретен В., Фрей Дж. Бовайн Bacillus anthracis в Камеруне. Appl Environ Microbiol. 2011;77:5818–21.

    КАС Статья Google ученый

  • Блэкберн Дж.К., Одугбо М.О., Ван Эрт М., О’Ши Б., Маллинз Дж., Перрентен В. и др. Разнообразие и географический потенциал Bacillus anthracis в Нигерии, Камеруне и Чаде: дальнейшая поддержка новой западноафриканской линии.PLoS Negl Trop Dis. 2015;9:e0003931.

    Артикул Google ученый

  • Клее С.Р., Озель М., Аппель Б., Бош С., Эллерброк Х., Джейкоб Д. и др. Характеристика Bacillus anthracis -подобных бактерий, выделенных от диких человекообразных обезьян из Кот-д’Ивуара и Камеруна. J Бактериол. 2006; 188: 5333–44.

    КАС Статья Google ученый

  • Клее С.Р., Бжушкевич Э.Б., Наттерманн Х., Брюггеманн Х., Дупке С., Воллхерр А. и другие.Геном изолята Bacillus , вызывающего сибирскую язву у шимпанзе, сочетает в себе хромосомные свойства B. cereus с плазмидами вирулентности B. anthracis . ПЛОС Один. 2010;5:e10986. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010986.

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Price EP, Seymour ML, Sarovich DS, Latham J, Wolken SR, Mason J, et al. Молекулярно-эпидемиологическое исследование вспышки сибирской язвы среди потребителей героина, Европа.Эмердж Инфекция Дис. 2012;18:1307–13.

    КАС Статья Google ученый

  • Блэкберн Дж. К., Маллинз Дж. К., Ван Эрт М., Хэдфилд Т., О’Ши Б., Хью-Джонс М.Э. Путь передачи сибирской язвы мухами-некрофагами: эмпирические и генетические данные эпизоотии диких животных в Западном Техасе, 2010 г. Vector Borne Zoonotic Dis. 2014; 14: 576–83.

    Артикул Google ученый

  • Van Ert MN, Easterday WR, Huynh LY, Okinaka RT, Hugh-Jones ME, Ravel J, et al.Глобальная генетическая популяционная структура Bacillus anthracis . ПЛОС Один. 2007;2:e461.

    Артикул Google ученый

  • Carlson CJ, Kracalik IT, Ross N, Alexander KA, Hugh-Jones ME, Fegan M, et al. Глобальное распространение Bacillus anthracis и связанный с этим риск сибирской язвы для людей, домашнего скота и диких животных. Нат микробиол. 2019. https://doi.org/10.1038/s41564-019-0435-4.

    КАС Статья Google ученый

  • Антонион К.С., Грюцмахер К., Дупке С., Мабон П., Циммерманн Ф., Ланкестер Ф. и др. Bacillus cereus , биовар anthracis , вызывающий сибирскую язву в странах Африки к югу от Сахары – хромосомная монофилия и широкое географическое распространение. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10:e0004923.

    Артикул Google ученый

  • Шеллинг Э., Бешир М., Ахмед М.А., Висс К., Рэндольф Т.Ф., Зинстаг Дж. Вакцинация людей и животных в отдаленные кочевые семьи, Чад. Эмердж Инфекция Дис. 2007; 13: 373–9.

    Артикул Google ученый

  • Шеллинг Э.Здоровье человека и животных у кочевников-скотоводов Чада: зоонозы, заболеваемость и медицинские услуги; 2002.

    Google ученый

  • Кейм П., Ван Эрт М.Н., Пирсон Т., Фоглер А.Дж., Хьюн Л.И., Вагнер Д.М. Молекулярная эпидемиология и судебная экспертиза сибирской язвы: использование подходящего маркера для разных эволюционных масштабов. Заразить Генет Эвол. 2004; 4: 205–13.

    КАС Статья Google ученый

  • Пило П., Фрей Дж. Bacillus anthracis : молекулярная таксономия, популяционная генетика, филогения и патоэволюция. Заразить Генет Эвол. 2011;11:1218–24.

    КАС Статья Google ученый

  • Vogler AJ, Busch JD, Percy-Fine S, Tipton-Hunton C, Smith KL, Keim P. Молекулярный анализ устойчивости к рифампину в Bacillus anthracis и Bacillus cereus . Противомикробные агенты Chemother. 2002;46:511–3.

    КАС Статья Google ученый

  • Хью-Джонс М.Глобальный отчет по сибирской язве за 1996-97 гг. J Appl Microbiol. 1999; 87: 189–91.

    КАС Статья Google ученый

  • Хью-Джонс М. Глобальные тенденции заболеваемости сибирской язвой среди скота; 1990. с. 2–4.

    Google ученый

  • Kracalik IT, Kenu E, Ayamdooh EN, Allegye-Cudjoe E, Polkuu PN, Frimpong JA, et al. Моделирование экологической приемлемости сибирской язвы в Гане и оценка групп риска: последствия для вакцинации и контроля.PLoS Negl Trop Dis. 2017;11:e0005885.

    Артикул Google ученый

  • Хендрикс К.А., Райт М.Э., Шадоми С.В., Брэдли Дж.С., Морроу М.Г., Павия А.Т. и др. Совещания экспертов Центров по контролю и профилактике заболеваний по профилактике и лечению сибирской язвы у взрослых. Эмердж Инфекция Дис. 2014;20(2). https://doi.org/10.3201/eid2002.130687.

  • Разнообразные системы токсинов и антитоксинов LXG специфически опосредуют внутривидовую конкуренцию в биопленках Bacillus subtilisPLoS Genet 17(7): е1009682. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682

    Редактор: Акош Т. Ковач, Danmarks Tekniske Universitet, ДАНИЯ

    Получено: 17 ноября 2020 г.; Принято: 25 июня 2021 г .; Опубликовано: 19 июля 2021 г.

    Copyright: © 2021 Кадзуо Кобаяши. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах вспомогательной информации.

    Финансирование: Автор(ы) не получали специального финансирования для этой работы.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Как и многие формы жизни, бактерии являются социальными организмами, которые должны постоянно конкурировать или сотрудничать друг с другом. Эти взаимодействия играют решающую роль в ассоциированных с поверхностью бактериальных сообществах, называемых биопленками.В биопленках миллионы или миллиарды клеток растут, прикрепляясь к соседним клеткам или поверхности, и эти клетки биопленки заключены в матрикс из внеклеточных полимерных веществ [1], который защищает клетки биопленки от антибиотиков, токсинов и иммунной системы хозяина. 2,3]. Экологические биопленки обычно состоят из нескольких видов бактерий, что может способствовать лучшему использованию питательных веществ, деградации токсичных соединений или устойчивости к суровым условиям окружающей среды [4]. Считается, что многовидовые биопленки развиваются в результате ряда внутри- и межвидовых взаимодействий.В этих взаимодействиях бактерии дистанцируются от неблагоприятных конкурентов или превосходят их, а также продвигают выгодных соседей для повышения их приспособленности. Неблагоприятными конкурентами часто являются одни и те же или близкородственные виды, поскольку они имеют общие генетические признаки и предпочтительные ниши [1,5]. Другим видом неблагоприятных конкурентов являются «мошенники-халявщики», которые потребляют внеклеточные продукты, такие как полимерные вещества, ферменты, метаболиты и сигнальные молекулы, не внося свой вклад [5]. Одним из механизмов исключения родственных конкурентов является дискриминация родственников, при которой бактерии отличают своих родственников от неродственных и предпочтительно связываются с близкими родственниками, чтобы сформировать кооперативную группу [5].Исключение родственных конкурентов также является превентивной мерой против потенциальных мошенников, поскольку родственные штаммы лучше используют внеклеточные продукты из-за их генетического родства. Однако механизмы конкуренции и родственной дискриминации в биопленках еще предстоит выяснить.

    Бактерии выработали разнообразные антибиотики и токсины, чтобы противодействовать конкурентам и различать родственников [6–11]. Среди них полиморфные токсины широко распространены среди бактерий и служат оружием, особенно для межбактериальной конкуренции между родственными штаммами [9–13].Полиморфные токсины представляют собой многодоменные белки, которые имеют общую доменную архитектуру, включающую N-концевые транспортные домены, различные центральные области и С-концевые полиморфные домены токсинов [12–14]. N-концевые домены переноса взаимодействуют с шаперонами или компонентами специализированных систем секреции и регулируют транспорт токсинов или доменов токсинов в клетки-реципиенты [12-14]. С-концевые домены токсинов заметно диверсифицированы и действительно классифицируются на более чем 150 отдельных доменов с различной активностью [12,13].Эти токсины также называются токсинами контактно-зависимого ингибирования (CDI), потому что эти токсины проявляют свои эффекты, когда продуценты токсинов физически вступают в контакт с другими клетками. При межклеточном контакте эти токсины доставляются от продуцентов токсинов к соседним клеткам через несколько клеточных оболочек с помощью специализированных систем секреции [14]. Например, системы секреции VI типа, консервативные у многих грамотрицательных бактерий, действуют как молекулярные шприцы, напрямую впрыскивающие токсины в соседние клетки с использованием энергии гидролиза АТФ [15,16].Введенные токсины подавляют или убивают реципиентные клетки, которые не экспрессируют родственные антитоксины. Полиморфные гены токсинов обычно образуют опероны с нижестоящими генами антитоксинов, которые защищают продуцентов токсинов от их собственных токсинов. Антитоксины так же разнообразны, как и домены токсинов, и каждый антитоксин специфически нейтрализует родственный ему токсин, связываясь с доменом токсина [17]. Широкое разнообразие пар токсин-антитоксин позволяет каждому штамму иметь уникальный набор оперонов токсин-антитоксин и, таким образом, различать свое и чужое или родственное и неродственное.Таким образом, бактериальные штаммы, даже принадлежащие к одному виду, проявляют несовместимость друг с другом, если они имеют разные полиморфные токсин-антитоксиновые опероны. Эти полиморфные токсины могут эффективно функционировать в биопленках, в которых клетки растут в прямом контакте друг с другом. Однако, хотя системы полиморфных токсинов хорошо изучены у многих бактерий, особенно у представителей Proteobacteria, большинство исследований было проведено в условиях планктонного роста, а не в условиях биопленки.Насколько нам известно, было показано, что только несколько полиморфных токсинов влияют на сообщества биопленок через конкуренцию [11,18,19].

    Грамположительные почвенные бактерии B . subtilis образует прочные биопленки, такие как сложноструктурированные колонии на твердых средах, поддерживающих образование биопленок [20]. Б . Штаммы subtilis секретируют различные типы антибиотиков и токсинов, некоторые из которых обнаружены в биопленках [7,21,22]. Эти противомикробные препараты включают нерибосомальные пептидные и поликетидные антибиотики, белковые пептидные токсины, токсины CDI и лантибиотики [7,23–26].Состав генов синтеза антибиотиков и токсинов в B . Геномы subtilis варьируются от штамма к штамму, и каждый B . Штамм subtilis часто продуцирует отдельный набор противомикробных препаратов [7]. Предыдущие исследования в условиях отсутствия биопленки показали, что B . subtilis использует комбинацию нескольких противомикробных препаратов, а не рецепторов клеточной поверхности, чтобы отличать родственные штаммы от неродственных [8,27,28]. Таким образом, B . subtilis использует эксклюзивную систему дискриминации по родству, а B . Штаммы subtilis , продуцирующие разные наборы противомикробных препаратов, исключают друг друга. Хотя этот механизм может работать в биопленках, клетки в биопленках защищены матриксом биопленки и, следовательно, проявляют повышенную толерантность к противомикробным препаратам [2,3]. В биопленках диффузия противомикробных препаратов происходит медленнее и ограничивается высокой плотностью клеток и полимерами матрицы биопленки, а заряженные противомикробные препараты поглощаются полимерами матрицы биопленки [29–34].Некоторые противомикробные препараты не могут получить доступ к своим рецепторам на поверхности клеток в биопленках [35,36]. Доставка некоторых токсинов CDI физически ингибируется матричными полимерами биопленки [36–38]. Таким образом, не все антибиотики и токсины, произведенные по B . subtilis может работать в биопленках. Фактически, ранее мы показали, что пептидные токсины YIT и SDP B . subtilis проявляли разные свойства в биопленках, хотя эти токсины синтезируются гомологичными оперонами, yitPOM и sdpABC соответственно [26].В частности, токсин YIT проявлял свою токсичность специфичным для биопленки образом, тогда как активность токсина SDP ингибировалась в биопленках. Основываясь на этих наблюдениях, мы прогнозируем, что B . subtilis может продуцировать специальные антибиотики и токсины, которые могут функционировать как механизмы конкуренции, специфичные для биопленки. Однако о таких антибиотиках и токсинах не сообщалось.

    Транскрипция оперона yitPOM (кодирующего токсин YIT) индуцируется двухкомпонентной регуляторной системой DegS-DegU при формировании биопленки [26].В дополнение к оперону yitPOM предыдущие анализы транскриптома показали, что DegS-DegU индуцирует несколько генов антибиотиков и токсинов [39-42]. Мы предполагаем, что некоторые из этих токсинов могут функционировать в биопленках, подобно токсину YIT, и служить специфическими для биопленок механизмами конкуренции. Среди них пары yeeF-yezG , yqcG-yqcF , ywqJ-ywqK и yxiD-yxxE кодируют предполагаемые полиморфные токсины и антитоксины. Хотя некоторые из этих пар токсин-антитоксин были проанализированы в Escherichia coli [43,44], их биологические функции в B . subtilis остаются неясными. Эти токсины принадлежат к семейству токсинов LXG, которые имеют общие N-концевые домены LXG, вариабельные центральные области и различные С-концевые домены токсинов (рис. 1А). Токсины LXG широко распространены у Firmicutes [45]. В Streptococcus intermedius токсины LXG функционировали как токсины CDI и доставлялись в соседние клетки с помощью системы секреции типа VII (T7SS), убивая клетки-реципиенты [45]. T7SS также широко распространены у Firmicutes [46]. Хотя они имеют структурное разнообразие, T7SSs обычно содержат связанную с мембраной АТФазу семейства FtsK/SpoIIIC, которая формирует секреционную пору и, вероятно, активирует секрецию белка [46].Консервативные субстраты T7SS представляют собой небольшие белки (длиной около 100 аминокислотных остатков) семейства WXG100 [46]. Белки WXG100 принимают структуру пучка из четырех спиралей и образуют гомо- и гетеродимеры, которые секретируются T7SS [46,47]. Сигнальная последовательность для секреции Т7 была идентифицирована на С-конце белка WXG100 [47]. Домен WXG100 структурно подобен домену LXG и был предложен для обеспечения секреции токсинов LXG через T7SS [17] (рис. 1B). Действительно, белки WXG100 связывались с доменами LXG и способствовали экспорту токсинов LXG через T7SS в Streptococcus intermedius [45].Однако, поскольку игольчатая структура, которая могла бы доставлять токсины непосредственно в клетки-реципиенты, не была идентифицирована в T7SS, остается неясным, как T7SS доставляют токсины LXG реципиентам. В В . subtilis , T7SS кодируется опероном yukE , в котором первый и четвертый гены кодируют белок семейства WXG100 и белок семейства FtsK/SpoIIIC соответственно. Подобно предполагаемым генам токсина LXG, транскрипция оперона yukE активируется двухкомпонентной регуляторной системой DegS-DegU [48,49].Поэтому мы предполагаем, что предполагаемые токсины LXG и T7SS вместе могут играть роль в межбактериальной конкуренции в биопленках.

    Рис. 1. Системы LXG токсины-антитоксины в B . субтилис .

    (A) Множественное выравнивание токсинов LXG из B . subtilis штамм 3610. Выравнивание было построено с использованием NCBI COBALT (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) с настройками по умолчанию. Красный цвет указывает на высококонсервативные позиции, а синий указывает на более низкую консервативность.Красные линии — это пробелы в выравнивании. Расположение домена LXG, центральной области и домена токсина показано ниже выравнивания. (B) Межклеточная конкуренция, опосредованная системами токсин-антитоксин LXG. Токсины LXG нейтрализуются родственными антитоксинами в продуцентах токсинов. Белок WXG100 способствует зависимой от T7SS доставке токсинов LXG от продуцентов к реципиентам. Если реципиенты не экспрессируют родственные антитоксины, доставленные токсины LXG оказывают токсическое действие. Родственные домены токсинов и антитоксины показаны одним цветом.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682.g001

    Здесь мы обращаемся к этой гипотезе и исследуем функцию систем токсин-антитоксин LXG в B . субтилис . Мы показываем, что B . Штаммы subtilis имеют несколько различных систем токсинов LXG, которых достаточно для различения своих и чужих. Кроме того, токсины LXG специфически опосредуют внутривидовую конкуренцию в биопленках. Мы также показываем, что B . subtilis использует различные типы полиморфных токсинов в зависимости от способа роста.

    Результаты

    Распространение токсинов LXG и родственных антитоксинов в

    B . subtilis штаммы

    B . subtilis неодомашненный штамм NCIB 3610 (далее именуемый 3610 или штамм дикого типа) широко использовался в исследованиях биопленок. Этот штамм имеет семь потенциальных генов токсина LXG; шесть ( yeeF , yobL , yokI , yqcG , ywqJ и yxiD ) находятся на его хромосоме, и один (QCX9201) находится на эндогенной большой плазмиде pBS32. Три хромосомных гена, yobL , yokI и yqcG , находятся на профагоподобном элементе 6, профаге SPβ и фаговом sigK промежуточном ( skin) элементе 91,014 соответственно. Эти семь токсинов, длина которых составляет от 531 до 669 аминокислот, имеют N-концевые домены LXG (Pfam, PF04740; 202 аминокислоты) (рис. 1А), хотя последовательность домена LXG YxiD менее похожа на последовательность других токсинов. (S1A рис.).Эти токсины имеют разные С-концевые токсинные домены. Их нисходящие гены кодируют предполагаемые антитоксины, которые не имеют значительного сходства [43,44]. Эти наблюдения предполагают, что каждая пара токсин-антитоксин может функционировать независимо.

    Если токсины и антитоксины LXG опосредуют внутривидовую конкуренцию, каждый B . Штамм subtilis может иметь разные опероны токсин-антитоксин LXG. Чтобы проверить эту гипотезу, мы проанализировали распределение генов токсина LXG в 12 полностью секвенированных B . subtili s в дополнение к штамму 3610. Они включали различные штаммы B . subtilis штаммов, включая четыре B . subtilis подвидов, subtilis , natto , spizizenii и globigii (рис. S2). Чтобы идентифицировать гомологи токсина LXG в этих штаммах, мы провели поиск NCBI BLASTp, используя в качестве приманки комбинированную последовательность двух отдаленно родственных токсинов LXG, YeeF и YxiD. В этом поиске мы собрали белки с доменами LXG и потенциальными доменами токсина, но исключили белки только с доменами LXG, укороченными доменами LXG или без потенциальных доменов токсина.В результате мы идентифицировали 59 гомологов токсина LXG в 12 штаммах в дополнение к семи токсинам LXG в штамме 3610. Каждый из 13 штаммов, включая штамм 3610, имел от трех до девяти гомологов токсина LXG, при этом большинство штаммов имели пять гомологов. . Филогенетический анализ и анализ организации генов показали, что эти 66 токсинов LXG были разделены на 17 групп (S3, рис. и таблица 1). Каждая группа белков имела очень похожие домены LXG и центральные области. Шесть групп были дополнительно разделены на 20 подгрупп на основе различий в доменах токсинов.Например, десять гомологов YeeF, кодируемых в одном и том же положении в каждом геноме, были разделены на четыре подгруппы. Каждый белок в этих подгруппах имел специфичные для подгруппы замены на С-конце домена токсина, но обладал общим неспецифическим эндонуклеазным мотивом ДНК-РНК (рис. S4A). Гомологи YobL и YokI, две подгруппы группы YobL, имели очень похожие домены LXG и центральные области, но совершенно разные последовательности доменов токсина (рис. S4B). Точно так же каждая подгруппа групп YqcG, YwqJ и YxiD имела разные домены токсина (рис. S4C и S4D).Хотя токсиновые белки LXG в группах YxiD и G были отнесены к разным группам, эти белки, вероятно, имеют общее происхождение, поскольку они кодировались в одном и том же геномном положении и имели почти одинаковую последовательность N-концевого домена LXG (рис. S4E). . Аналогичное наблюдение было сделано для групп YobL и C, в которых белки имели очень похожие N-концевые домены LXG (рис. S4B). Классификация также показала, что B . Штаммы subtilis имели много белков-токсинов LXG, которые не были обнаружены в штамме 3610, которые также образовывали несколько групп.Таким образом, 66 потенциальных токсинов LXG можно разделить на 31 группу и подгруппу (таблица 1 и таблица S1). Поиск мотивов с использованием базы данных Pfam показал, что домены токсинов 18 групп и подгрупп содержат известные мотивы токсинов, 14 из которых являются нуклеазными мотивами (таблица S1).

    Затем мы исследовали, были ли родственные антитоксины такими же разнообразными, как токсины LXG. Родственные антитоксины обычно кодируются сразу после генов токсинов. Фактически, многие гены, расположенные ниже токсинов LXG, кодируют белки, содержащие типичные антитоксинные мотивы, такие как Pfam PF14567, PF15601 и PF18624 (таблица S1), хотя гены токсинов LXG группы G не имеют нижележащих генов антитоксинов.Филогенетический анализ показал, что нижележащие антитоксины можно разделить на 30 групп (рис. S5). Эта модель классификации полностью соответствовала модели токсинов LXG; то есть антитоксины образовывали филогенетические группы, соответствующие группам или подгруппам токсинов LXG. Таким образом, за исключением орфанных токсинов LXG группы G, токсинов LXG и антитоксинов в 13 B . Штаммы subtilis , вероятно, образовали 30 пар специфичности (таблица 1 и таблица S1). 13 В . Штаммы subtilis содержали от трех до девяти различных пар токсин-антитоксин LXG, что позволяло различать эти штаммы.Широкое распространение разнообразных токсинов и антитоксинов LXG предполагает, что системы токсин-антитоксин LXG могут играть роль во внутривидовой конкуренции у B . субтилис .

    Обратите внимание, что количество групп и подгрупп токсина LXG увеличивается по мере увеличения количества включенных B . subtilis штаммов увеличивается. Например, мы идентифицировали 823 токсина LXG с помощью поиска NCBI BLASTp против B . subtilis (taxid, 1423), который включает 85 B . subtilis штаммов. Среди этих токсинов 79 были гомологами YeeF, которые можно было разделить на десять подгрупп на основе различий в доменах токсинов (S6 Fig).

    Экспрессия токсинов LXG

    Для проверки работоспособности систем токсин-антитоксин LXG в B . subtilis , мы проанализировали экспрессию шести оперонов токсин-антитоксин LXG, закодированных на хромосоме штамма 3610. Мы слили промоторные области этих оперонов с репортером зеленого флуоресцентного белка (GFP) без промотора и ввели полученный промотор- gfp . репортеров в хромосому 3610.Экспрессию репортеров gfp в отдельных клетках измеряли с помощью проточной цитометрии, в которой дикий тип (без репортера gfp ) использовали в качестве отрицательного контроля. Штаммы дикого типа и gfp -reporter выращивали при энергичном встряхивании до OD 600 0,7–0,8 в среде LB, богатой комплексами, которая не способствует образованию биопленки. На этой стадии шесть репортеров не экспрессировались, так как эти штаммы проявляли такую ​​же сильную флуоресценцию, как и штаммы дикого типа (предварительная культура на рис. 2).Затем эти культуры высевали на три твердые среды: минимальную среду MSgg, способствующую образованию биопленок [20], комплексную среду 2×SGG, способствующую образованию биопленок [50], и LB, и анализировали экспрессию репортеров gfp в колониях. более 48 ч. На среде MSgg экспрессия шести репортеров индуцировалась через 12 и 24 часа и снижалась через 48 часов (рис. 2). На богатой среде 2×SGG шесть репортерных штаммов экспрессировали GFP на более высоких уровнях, чем на MSgg через 24 часа, и демонстрировали чрезвычайно широкие пики гистограммы, что указывает на то, что часть клеток экспрессировала GFP на очень высоких уровнях.Экспрессия репортеров снижалась через 48 ч, как это наблюдалось с MSgg. На другой богатой среде, LB, шесть репортерных штаммов также экспрессировали больше GFP, чем на MSgg. Однако, в отличие от 2×SGG, штаммы демонстрировали острые гомогенные пики гистограммы. Эти результаты показывают, что B . subtilis экспрессирует шесть оперонов токсин-антитоксин LXG на богатых и минимальных средах, вероятно, в ранней стационарной фазе, и что некоторые клетки экспрессируют эти опероны на довольно высоких уровнях в богатых питательными веществами условиях, способствующих биопленке.

    Рис. 2. Экспрессия оперонов токсин-антитоксин LXG.

    Штаммы, несущие промотор- gfp репортеров, выращивали до ОП 600 от 0,7 до 0,8 в жидкой LB (прекультура, 0 ч). Культуры разбавляли до OD 600 0,5, и 2 мкл разведений наносили на три твердые среды: MSgg, 2×SGG и LB. Через 12 ч, 24 ч или 48 ч инкубации при 30°С экспрессию репортеров gfp в колониях измеряли с помощью проточной цитометрии. Штамм 3610 (без репортера gfp ) использовали в качестве отрицательного контроля.Для каждого штамма показаны два набора данных. Все гистограммы показаны в одном масштабе, а значения для осей x и y показаны только на нижней левой гистограмме. Положения пиков флуоресценции от штамма 3610 указаны пунктирными линиями в качестве фона.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682.g002

    Поскольку предыдущие исследования показывают, что yeeF , yqcG , ywqH и yxiB положительно регулируются двухкомпонентными оперонами регуляторной системы DegS-DegU [39–42], мы исследовали влияние удаления degU на репортеров.Мутация δ degu предотвратила выражение P yeef -GFP , P YQCG YQCG -GFP , P YWQH -GFP , а P YXIB -gfp репортеры в трех СМИ, но не репортеры P yobL -gfp или P yokI -gfp (рис. 2). Таким образом, шесть оперонов токсин-антитоксин LXG можно разделить на два класса: зависимые от DegSU и независимые от DegSU.

    In vivo Активность токсинов LXG и антитоксинов

    Чтобы определить, обладают ли шесть систем токсин-антитоксин LXG биологической активностью в B . subtilis , мы поместили только гены токсина LXG или опероны токсина и антитоксина LXG под контроль IPTG-индуцируемого, LacI-репрессируемого промотора spac -hy [51] в локусе amyE хромосомы. Индукция любого из шести токсинов LXG сильно ингибировала образование колоний (рис. 3А слева), тогда как индукция любого из шести оперонов токсина и антитоксина LXG не ингибировала образование колоний (рис. 3А справа).Эти результаты показывают, что эти шесть пар функционируют как эффективные системы токсин-антитоксин. Мы пытались определить активность токсина. При встряхивании культуры индукция любого из шести токсинов приводила к немедленному прекращению роста, но не приводила к резкому лизису клеток (рис. 3В). Поскольку токсины YeeF, YobL, YokI и YqcG содержат нуклеазные мотивы (таблица S1), мы выделили хромосомную ДНК и рибосомную РНК (рРНК) из клеток до и через 1 ч после индукции токсинов LXG. Индукция YeeF, YobL, YokI, YqcG и YxiD вызвала значительное уменьшение количества хромосомной ДНК (рис. 3C).Чтобы измерить содержание клеточной ДНК, мы окрашивали клетки ДНК-связывающим флуоресцентным красителем, йодидом пропидия. Анализ с помощью проточной цитометрии показал, что индукция YeeF, YobL, YokI, YqcG и YxiD приводит к образованию безъядерных клеток (рис. S7). Хотя С-концевые домены токсинов YobL, YokI и YqcG функционировали как РНКазы при экспрессии в Escherichia coli [43, 44], эти результаты показывают, что токсины YeeF, YobL, YokI, YqcG и YxiD функционируют как ДНКазы в . Б . субтилис . Напротив, индукция YwqJ не влияла на хромосому или рРНК, несмотря на заметное влияние на рост (рис. 3В и 3С).YwqJ, имеющий неизвестный дезаминазоподобный мотив, может действовать на небольшие молекулы.

    Рис. 3. In vivo Активность токсинов и антитоксинов LXG.

    (A) Индукция токсинов LXG предотвращает образование колоний. Ночные культуры штаммов гена токсина P spac -hy -LXG (левые панели) и штаммов P spac -hy -LXG токсин-антитоксин оперон (правые панели) серийно разбавляли, и 2 мкл разведений наносили на твердые среды LB с 1 мМ IPTG или без него.В качестве эталона использовали штамм дикого типа. Затем планшеты инкубировали при 37°С в течение 18 часов. (B) Репрезентативные кривые роста штаммов гена токсина дикого типа (WT) и P spac -hy -LXG. Штаммы выращивали при 37°C в LB при энергичном встряхивании и отслеживали оптическую плотность при OD 600 во времени. IPTG (конечная концентрация 1 мМ) добавляли в указанный момент времени (0 ч). (C) Содержание ДНК и РНК в клетках до и после индукции токсинов LXG. Клетки собирали в 0 ч и 1 ч, как показано на панели B, образцы тотальной ДНК и РНК выделяли, а образцы из 0.Затем клетки 03 OD анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Положения хромосомной ДНК и рРНК указаны стрелками. Показаны результаты двух независимых экспериментов.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682.g003

    Токсины LXG опосредуют межклеточную конкуренцию

    Чтобы проверить, опосредуют ли шесть оперонов токсин-антитоксин LXG межклеточную конкуренцию, мы сконструировали соответствующие делеционные мутанты. У делеционных мутантов отсутствовали гены токсина и антитоксина или целые опероны, включающие гены токсина и антитоксина, а именно: K ), δ yoki-yokj yoki j j ), δ yqef-yqcg yqef g ), δ ywqh-ywqi-ywqj-ywqk-ywql ( Δ ywqH L ) и Δ yxiB-yxiC-yxiD-yxxD-yxxE yxiB E ).Делеция этих генов токсина и антитоксина практически не влияла на рост, поскольку эти мутанты росли и образовывали биопленки колоний (морщинистые колонии) способом, сравнимым со штаммом дикого типа (S8 Fig). Мы провели анализ конкуренции один к одному между делеционными мутантами и штаммом дикого типа. Если токсины LXG функционируют как межклеточные токсины, то токсины, продуцируемые штаммом дикого типа, должны убивать или подавлять делеционные мутанты, которые не могут продуцировать требуемый антитоксин. Чтобы отличить клетки дикого типа от мутантных, мы ввели конститутивно экспрессируемый репортер gfp в хромосомы мутантов.Штамм дикого типа и мутанты, меченные GFP, выращивали при энергичном встряхивании до OD 600 0,7–0,8 в LB. На этой стадии клетки не экспрессировали опероны токсин-антитоксин LXG, как показано на рис. 2. Затем разведенные культуры (ОП 600 0,5) смешивали в соотношении 1:1 штамма дикого типа к делеционному мутанту и наносили на твердая среда MSgg. Начальная плотность клеток составляла 1,8 × 10 5 клеток на пятно (диаметр 2–3 мм), в среднем ( n = 8) (набор данных S1). После инокуляции долю мутантных клеток, меченных GFP, в колониях анализировали в течение 48 ч с помощью проточной цитометрии.Штамм дикого типа превзошел все шесть мутантов на 48 ч при разных скоростях (рис. 4А). В частности, доля мутантных клеток Δ yxiB E в колониях уменьшилась до <10% к 12 ч, тогда как доля Δ yeeF K , Δ yqcG F, Δ yqcG – F ywqH L мутантов уменьшилась до ~10% к 24 часам. Доля мутантов Δ yobL K и Δ yokI J постепенно снижалась до 48 ч.Такого изменения соотношения не наблюдалось при совместном культивировании дикого типа и дикого типа с репортером gfp . Дефект приспособленности этих мутантов был устранен путем эктопической экспрессии антитоксинов с IPTG-индуцируемого промотора spac -hy на хромосомах (фиг. 4В). Эти результаты демонстрируют, что шесть систем токсин-антитоксин LXG опосредуют межклеточную конкуренцию.

    Рис. 4. Токсины и антитоксины LXG опосредуют межклеточную конкуренцию.

    (A) Анализ динамики конкуренции.Штамм дикого типа и мутанты с делецией токсин-антитоксин LXG, несущие конститутивно экспрессированный репортер gfp (штаммы GFP), выращивали до OD 600 0,7–0,8. и точно разведенные культуры (OD 600 0,5) дикого типа и одного из мутантов смешивали в соотношении 1:1. Точные пропорции штаммов GFP в смесях определяли с помощью проточной цитометрии и использовали в качестве образцов времени 0. Смеси наносили на твердую среду MSgg, после чего инокулированные чашки инкубировали при 30°C.Долю штаммов-репортеров GFP в колониях в каждый момент времени определяли с помощью проточной цитометрии с использованием трех независимых колоний. Проценты представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3). (B) Индукция антитоксинов восстанавливала конкурентоспособность мутантов с делецией токсин-антитоксин. Гены антитоксина эктопически индуцировали из IPTG-зависимого промотора spac -hy в локусе amy мутантных хромосом. Указанные штаммы совместно культивировали на среде MSgg с добавлением 0.1 мМ ИПТГ. Проценты представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682.g004

    T7SS требуется для доставки токсина LXG

    В S . intermedius , токсины LXG функционировали как токсины контактно-зависимого ингибирования (CDI) [45]. С . intermedius имеет три гена токсина LXG, каждый из которых образует оперон с родственными генами антитоксина и белка WXG100 [45].Белки WXG100 связываются с родственными токсинами LXG и способствуют их экспорту через систему секреции типа VII (T7SS) [45]. В В . subtilis , опероны токсин-антитоксин LXG не содержат генов белка WXG100. Белок WXG100 (YukE) и T7SS кодируются семигенным опероном yukEDCB-yueBCD в B . subtilis [48]. Если для доставки токсина LXG требуются WXG100 и T7SS, в B . subtilis , то делеционный мутант всего оперона yukE yukE D ) не должен вызывать токсин-зависимую токсичность LXG.Анализ конкуренции один к одному показал, что, в отличие от дикого типа, Δ yukE D не превосходил в конкуренции ни один мутант токсин-антитоксин LXG с делецией (рис. 5A вверху). Мутант Δ yukE D сам по себе не имел дефекта приспособленности, поскольку в конкурентных анализах он показал такие же результаты, как и дикий тип. Эти результаты показывают, что мутация Δ yukE D предотвращает доставку токсина, не влияя на выработку антитоксина. Чтобы различать эффекты WXG100 и T7SS на доставку токсина, мы сконструировали безмаркерные внутрирамочные делеционные мутанты yukE и yukC и проверили их конкурентоспособность.Анализ конкуренции один к одному показал, что как мутант WXG100 Δ yukE , так и мутант T7SS Δ yukC не превосходили ни один мутант с делецией токсина-антитоксина LXG (рис. 5A в середине). Эктопическая экспрессия yukE или yukC дополняла соответствующие делеционные мутации, поскольку комплементированные штаммы превосходили мутанты с делецией токсин-антитоксин LXG (нижняя часть рис. 5A). Эти результаты показывают, что шесть токсинов LXG доставляются к бактериальным клеткам-мишеням в виде YukE (белок WXG100) и T7SS-зависимого способа в B . субтилис . Доставке трех токсинов LXG способствовали различные белки WXG100 в S . intermedius [45], в то время как доставка шести токсинов LXG, вероятно, стимулировалась одним белком WXG100, YukE in B . субтилис . Это различие, вероятно, связано с тем, что в отличие от токсинов LXG B . subtilis , домены LXG S . Токсины intermedius LXG менее похожи друг на друга (рис. S1B). Экспрессия оперона yukE позитивно регулируется двухкомпонентной системой DegS-DegU [49].Хотя два оперона токсин-антитоксин LXG экспрессировались независимо от DegS-DegU, эти наблюдения предполагают, что все шесть систем токсин-антитоксин LXG прямо или косвенно регулируются DegS-DegU.

    Рис. 5. T7SS требуется для доставки токсина LXG.

    (A) Анализ конкуренции между мутантами токсин-антитоксин LXG с делецией и мутантами T7SS. Штаммы совместно культивировали в течение 48 ч на среде MSgg. Анализы конкуренции с использованием δ YUKE P SPAC -HY

    2 – YUKE и δ YUKC и δ YUKC P SPAC -HY

    2 – Mutantants были сделаны на MSGG, дополненные 0.1 мМ ИПТГ. (B) Снижение начальной плотности клеток, вызванное пространственно сегрегированным ростом. Культуры (OD 600 0,5) дикого типа с репортером gfp или без него смешивали в соотношении 1:1. Смеси разбавляли от 1 до 100 раз и 2 мкл разбавленных смесей наносили на твердую среду MSgg. Через 48 ч колонии наблюдали с помощью стереомикроскопа. Виды сверху — это изображения колонии, а виды снизу — увеличенные изображения центра колонии. Масштабные линейки, 2 мм (вверху) и 0.2 мм (внизу). (C) Формирование кластера предотвратило действие токсина LXG. Конкурентные анализы проводились с использованием разбавленных смесей для инокуляции. Проценты представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682.g005

    Токсины LXG, как ожидается, будут функционировать как токсины CDI и будут доставляться в периплазму или цитоплазму клеток-реципиентов [45]. В отличие от диффундирующих токсинов, токсины CDI требуют межклеточного контакта для проявления своего эффекта [52].Однако некоторые производители токсинов ИКД не могут убить или подавить конкурентов, если конкуренты образуют кластеры до того, как столкнутся с производителями токсина [53,54]. Это явление, известное как стадная защита, вызвано накоплением мертвых клеток на межлинейных границах. Накопленные мертвые клетки образуют физические барьеры и не позволяют производителям токсина ИКД контактировать с новыми клетками-конкурентами. Чтобы определить, функционируют ли токсины LXG как токсины CDI, мы проверили влияние образования кластеров на эффективность токсинов LXG.Во-первых, мы проверили, позволяет ли снижение исходной плотности клеток двум штаммам образовывать отдельные кластеры на твердой среде перед столкновением друг с другом, что приводит к пространственному сегрегированному росту в полученных колониях. Когда смесь 1:1 дикого типа и дикого типа с репортером gfp инокулировали на MSgg без разбавления, вся колония проявляла флуоресценцию GFP (рис. 5B, 1× вверху), что указывает на то, что два штамма росли вместе. . Контраст между областями GFP-high и GFP-low становился более четким по мере разбавления инокуляционных смесей.Разбавление инокуляционной смеси в 100 раз позволило двум штаммам четко сформировать сильные и слабые GFP-флуоресцентные участки радиально в периферических областях колонии, которые расширялись наружу (рис. 5B, 100× сверху). Увеличенные изображения показали, что срезы с сильной и слабой флуоресценцией GFP также имели пятнистое распределение в структурах морщин в центральных областях колонии, которые расширялись вверх (рис. 5B, 100× внизу). Таким образом, снижение исходной плотности клеток приводило к пространственно-разделенному росту колоний. Затем мы провели конкурентные анализы, используя 10-кратные и 100-кратные разведенные смеси мутантов дикого типа и мутантов токсин-антитоксин LXG с делецией.Снижение исходной плотности клеток значительно ослабляло действие токсинов LXG, особенно при 100-кратном разведении, в котором шесть мутантов LXG с делецией токсин-антитоксин не проявляли значительных дефектов приспособленности по сравнению с диким типом (рис. 5C). Эти результаты показывают, что защита стада эффективна против токсинов LXG, и, таким образом, токсины LXG, вероятно, действуют как токсины CDI.

    Токсины LXG опосредуют конкуренцию, в частности, в биопленках

    Как описано выше, уровни экспрессии оперонов LXG токсин-антитоксин различались в зависимости от условий среды.Поэтому мы исследовали, оказывают ли токсины LXG различные эффекты в зависимости от условий среды. На среде 2×SGG мутанты LXG с делецией токсин-антитоксин уступали дикому типу через 48 часов, как это наблюдалось на среде MSgg (рис. 6A). Напротив, эти делеционные мутанты показали себя почти так же хорошо, как дикий тип, в конкурентных анализах на LB (рис. 6A), хотя системы токсин-антитоксин LXG экспрессировались в LB (рис. 2). Поскольку, в отличие от среды LB, среды MSgg и 2×SGG способствуют образованию биопленки, мы предположили, что системы токсинов LXG могут специфически работать в биопленках.Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали влияние ингибирования образования биопленки на функцию токсина LXG в двух экспериментах. Во-первых, мы провели анализ конкуренции в условиях встряхивания, что предотвращает образование биопленки. При встряхивании жидкости в культуре со средой MSgg все шесть мутантов показали себя почти так же, как дикий тип в конкурентных анализах (фиг. 6B). Во-вторых, мы проведены анализы конкуренции в EPSA – O , δ TASA , и EPSA , и δ EPSA O δ TATA TASA Мутантные фоны.Поскольку опероны epsA O и tapA-tasA необходимы для синтеза матриксных полимеров биопленки, экзополисахаридов и амилоидных полимеров TasA, соответственно, удаление этих оперонов отменяет образование биопленки [20,55–57]. В Δ EPSA O , δ TASA TASA , и δ EPSA O δ TAPA TASA Фон, пропорции токсин-антитоксиновых удаленных мутантов Δ Yeef -G , Δ yobL-K , Δ yokI-J и Δ ywqH-L в колониях оставались почти постоянными или лишь незначительно уменьшались на MSgg (фиг. 6C).Доля мутанта Δ yqcG-F в колониях незначительно снижалась только на фоне Δ epsA O Δ tapA tasA . Эти результаты показывают, что токсины YeeF, YobL, YokI, YqcG и YwqJ нуждаются в экзополисахаридах и амилоидных полимерах TasA для их полной функции. Напротив, доля мутанта Δ yxiB-E оставалась очень низкой в ​​совместно культивируемых колониях даже на фоне Δ epsA O Δ tapA tasA .Эти наблюдения показывают, что для доставки токсина YxiD может потребоваться неизвестный фактор, который, вероятно, индуцируется в условиях биопленки.

    Рис. 6. Системы токсин-антитоксин LXG специфически функционируют в биопленках.

    (A) Анализ конкуренции со штаммом дикого типа и мутантами LXG с делецией токсин-антитоксин на трех разных твердых средах. (B) Анализ конкуренции со штаммом дикого типа и мутантами с делецией токсин-антитоксин LXG в культуре при встряхивании жидкости. Штаммы совместно культивировали в течение 24 ч в жидкой среде MSgg при энергичном встряхивании.(C) Для функционирования токсина LXG требовались матричные полимеры биопленки. Анализы конкуренции проводились на мутантных фонах Δ epsA O (вверху) или Δ tapA tasA (внизу). Проценты представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682.g006

    Дуэли между мутантами с делецией токсин-антитоксин

    Биоинформационный анализ предсказал, что каждый B .Штамм subtilis продуцирует другой набор токсинов-антитоксинов LXG; таким образом, B . Штаммы subtilis могут атаковать друг друга, и в опосредованной токсином-антитоксином конкуренции LXG между B не ожидается простых отношений хищник-жертва. subtilis штаммов. Чтобы воспроизвести ситуацию, мы провели круговые дуэли между шестью делеционными мутантами токсин-антитоксин LXG, каждый из которых был чувствителен к одному из токсинов LXG, продуцируемых другими делеционными мутантами.Мы обнаружили смеси 1:1 двух делеционных мутантов токсин-антитоксин LXG (один из которых был помечен GFP) на твердой среде MSgg. Через 48 ч культивирования долю GFP-меченых штаммов в полученных колониях анализировали с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Круговые дуэли выявили иерархию активности шести токсинов LXG (рис. 7А). Токсины YxiD и YwqJ были самыми сильными и вторыми по силе токсинами соответственно. YxiD-чувствительный мутант Δ yxiB E подавлялся остальными пятью мутантами и, по-видимому, в основном отсутствовал в колониях.Точно так же YwqJ-чувствительный мутант Δ ywqH L подавлялся другими четырьмя мутантами, но не мутантом Δ yxiB E . Хотя дуэли показали, что порядок оставшихся четырех токсинов был YqcG = YeeF > YokI > YobL, исходя из потенции, дуэли между четырьмя мутантами, Δ yeeF-G , Δ yobL K , Δ yokI J и Δ yqcG F , не привели к окончательным результатам.В этих дуэлях четыре мутанта сформировали свои территории в колониях. Например, в deels с δ yobl k , δ k j , или δ yqcg yqcg F Мутант, Δ Yeef G ( GFP ) мутант, самый слабый из четырех, был пропорционально редуцирован, но образовывал участки, богатые флуоресценцией GFP, радиально в периферических областях колоний (рис. 7А). Пространственно разделенный рост наблюдался в складчатых структурах в центральных областях колоний (рис. 7В).Размер срезов, вероятно, зависел от активности токсинов LXG (рис. 7A и 7B). Такое образование секций редко наблюдалось в дуэлях между одними и теми же мутантами, например, Δ yeeF G против Δ yeeF G ( gfp ). Эти результаты показывают, что системы токсин-антитоксин LXG активировали B . subtilis , чтобы превзойти конкурентов или вызвать пространственную сегрегацию в сообществах. Как описано выше, опероны токсин-антитоксин LXG были высоко экспрессированы на среде 2×SGG.Поэтому мы провели те же дуэли на среде 2×SGG. Однако результаты не сильно отличались от результатов, наблюдаемых на среде MSgg (S9 Fig).

    Рис. 7. Круговые дуэли между шестью мутантами LXG с делецией токсин-антитоксин.

    (A) Указанные мутанты LXG с делецией токсин-антитоксин с репортером gfp или без него культивировали совместно в соотношении 1:1 на твердой среде MSgg. Через 48 ч долю репортерных штаммов GFP в колониях определяли как среднее ± стандартное отклонение ( n = 3).Также показаны флуоресцентные изображения колоний. Эксперименты проводились не менее трех раз, и репрезентативные примеры показаны на рисунках. Мутантные штаммы расположены слева (сверху) направо (снизу) в порядке конкурентоспособности. Масштабная линейка, 2 мм. (Б). Увеличенные изображения колониальных центров. Значения деформации GFP (%) взяты из панели A. Масштабная линейка, 0,2 мм. (C) Токсины LXG действуют синергически. Мутант Δ yxiB E с репортером gfp культивировали совместно с двойными мутантами токсин-антитоксин LXG.Долю репортерных штаммов GFP в колониях представляли как среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). Также показаны флуоресцентные изображения колоний. Масштабная линейка, 2 мм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682.g007

    B . Штаммы subtilis продуцируют несколько токсинов LXG, которые могут синергетически ингибировать конкурентов. Чтобы проверить эту возможность, шесть двойных мутантов токсин-антитоксин LXG культивировали совместно с самым слабым мутантом Δ yxiD E , несущим gfp .Как показано на рис. 7А, мутант Δ yxiD E ( gfp ) почти исчез из колоний при конкуренции с мутантами с одиночной делецией других токсин-антитоксиновых оперонов LXG. Напротив, δ yxid E E ( GFP ) Мутант образовался отдельные сектора в колониях в поединках с четырьмя двойными мутантами, Δ Yeef G δ Yoki j , δ yeef δ yqcg f , δ yqcg f δ yoki j или δ yqcg f δ ywqh l (рис. 7c).Таким образом, два токсина LXG, продуцируемые мутантом Δ yxiD E ( gfp ), могут конкурировать с наиболее мощным токсином YxiD, продуцируемым четырьмя двойными мутантами. Эти результаты показывают, что производство нескольких токсинов LXG увеличивает шансы штаммов расширить свою территорию и выжить в сообществах, даже если конкуренты производят мощные токсины LXG.

    Токсины LXG эффективны против природных изолятов

    Природные штаммы B . subtilis , вероятно, продуцирует другой набор токсинов LXG, чем штамм NCIB3610.Для дальнейшего изучения того, опосредуют ли системы токсин-антитоксин LXG внутривидовую конкуренцию, мы провели анализ конкуренции с использованием 26 природных изолятов B . subtilis , ранее выделенных из почвы [58]. В частности, меченный GFP штамм 3610 или мутант T7SS Δ yukE D смешивали поровну с одним из 26 природных изолятов, и смеси инокулировали на твердую среду MSgg. Если токсины LXG играют критическую роль во внутривидовой конкуренции, то мутант Δ yukE D , который не может доставлять токсины LXG конкурентам, не должен быть столь конкурентоспособным, как штамм дикого типа.Совместное культивирование штамма 3610, меченного GFP, с природными изолятами показало, что эти штаммы очень часто росли, исключая друг друга (рис. 8 и S10). В частности, либо штамм 3610, либо естественные изоляты стали доминирующими в 18 полученных колониях, поскольку эти колонии демонстрировали либо столько же флуоресценции GFP, сколько флуоресценция меченого GFP штамма 3610 (3610 доминирует, см. SUBC13 и совместное культивирование 3610 ( gfp ) на рис. 8) или только слабая флуоресценция GFP (преобладает SUBC, см. кокультуру SUBC17 и 3610 ( gfp ) на рис. 8).Эти колонии были морфологически очень похожи либо на колонии только штамма 3610, либо только на природные изоляты. В восьми других комбинациях совместного культивирования штамм 3610 и природные изоляты сосуществовали, но были пространственно разделены (рис. 8). Совместное культивирование мутанта T7SS Δ yukE D с восемью природными изолятами, которые сосуществовали со штаммом 3610, давало колонии, которые морфологически отличались от совместно культивируемых колоний штамма 3610 и природных изолятов. В большинстве колоний мутант Δ yukE D потерял территорию (светлая зона GFP) по сравнению с территорией штамма 3610 в соответствующих колониях (рис. 8).Мутант Δ yukE D рос с меньшей пространственной сегрегацией в сокультурах с SUBC34, чем штамм 3610. Мы не могли определить точное соотношение клеток в этих колониях, потому что эти природные штаммы образовывали длинные цепочки клеток и/или колонии, которые сильно прилипает к агаровой среде. Эти результаты демонстрируют, что токсины LXG играют определенную роль, по крайней мере, в некоторой внутривидовой конкуренции. Филогенетический анализ природных изолятов с использованием частичных последовательностей gyrA показал, что восемь штаммов, которые были чувствительны к токсинам LXG, продуцируемым штаммом 3610, принадлежали к двум кладам (S11 Fig).На важность токсинов LXG в межклеточной конкуренции, вероятно, влияют филогенетические отношения между штаммами.

    Рис. 8. Токсины LXG эффективны против природных изолятов B . субтилис .

    Меченый GFP штамм 3610 или мутант T7SS Δ yukE D культивировали совместно с штаммом B . subtilis природный изолят в соотношении 1:1 на среде MSgg. Через 48 ч культивирования морфологию и флуоресценцию GFP колоний наблюдали с помощью стереомикроскопа.Культуры с одним штаммом показаны в качестве эталонов. Отображаются выбранные результаты; полные результаты см. на рис. S10. Эксперименты были повторены дважды и подтвердили воспроизводимость. Классификация совместно культивируемых колоний указана справа. Масштабная линейка, 2 мм.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682.g008

    Разделение труда между антибиотиками и токсинами

    В . subtilis секретирует множество антибиотиков и токсинов [7].Предыдущее исследование предполагает, что каждый B . Штамм subtilis использует уникальную комбинацию этих противомикробных препаратов для различения родственных и неродственных в условиях роевой подвижности [8]. Вероятно, поэтому токсины LXG не всегда играли определяющую роль во внутривидовой конкуренции в биопленках; то есть антибиотики и токсины, отличные от токсинов LXG, вероятно, играли важную роль в определенных условиях соревнований. Чтобы сравнить важность других противомикробных препаратов с токсинами LXG во внутривидовой конкуренции, мы проанализировали распределение генов биосинтеза для 16 известных и предполагаемых секретируемых антибиотиков и токсинов в 13 B . subtilis штаммов (табл. 2). Эти противомикробные препараты представляли собой семейство полиморфных токсинов Rhs (WapA), белковые пептидные токсины (SDP, YIT, SDP3, SDP4 и SKF), лантибиотики (субланцин, субтилозин, субтилин и субтиломицин), нерибосомально синтезированные пептиды и поликетиды. антибиотики (сурфактин, плипастатин, микосубтилин, бацилицин и бациллаен) и аминосахарный антибиотик (канозамин) [7,23–26,59,60]. Обратите внимание, что эти 16 антибиотиков и токсинов, вероятно, не представляют всех противомикробных препаратов, секретируемых 13 штаммами, и, вероятно, существуют неизвестные противомикробные препараты.Эти гены антимикробного биосинтеза были неравномерно распределены среди 13 штаммов и имели некоторые вариации от штамма к штамму, как сообщалось ранее [8]. Однако штаммовая изменчивость этих противомикробных препаратов была менее распространена, чем у токсинов LXG. В частности, субтилозин, сурфактин, бацилицин, бациллаен и канозамин были хорошо сохранены в этих B . subtilis , что указывает на то, что эти противомикробные препараты опосредуют скорее межвидовую, чем внутривидовую конкуренцию.

    Среди этих антимикробных генов другой полиморфный токсин WapA вносил заметный вклад в изменчивость штамма, и его четыре варианта разделили 13 штаммов на пять групп (четыре с одним из вариантов WapA и один без WapA) (таблица 2). WapA представляет собой токсин CDI из 2334 аминокислот, состоящий из N-концевой сигнальной последовательности, центральной области, содержащей RHS-повторы, и С-концевого нуклеазного домена тРНК [24]. Его токсическая активность нейтрализуется антитоксином WapI, кодируемым непосредственно после wapA [24].WapA, вероятно, экспортируется через SecA-зависимый путь секреции и закрепляется на клеточных стенках [62], но точный механизм его доставки в клетки-реципиенты остается неясным. Нас интересовало сравнение токсинов WapA и LXG. Мы проанализировали экспрессию оперона wapAI в трех средах с использованием репортера P wapA -gfp . При выращивании с энергичным встряхиванием до OD 600 0,7–0,8 в жидком LB репортерный штамм P wapA -gfp -reporter демонстрировал высокие уровни флуоресценции GFP (рис. 9A 0 h).После инокуляции на твердые среды MSgg, 2×SGG и LB репортерный штамм P wapA -gfp -reporter также демонстрировал высокие уровни флуоресценции GFP через 12 и 24 ч, независимо от среды. Мутация Δ degU повышает экспрессию P wapA -gfp , как предполагалось ранее [39–42]. Эти результаты показывают, что wapAI экспрессировался во время более ранней фазы роста, чем опероны токсин-антитоксин LXG, и что DegS-DegU регулировал опероны wapAI и токсин-антитоксин LXG противоположным образом.

    Рис. 9. WapA обладает свойствами, отличными от токсинов LXG.

    (A) Экспрессия оперона wapAI токсин-антитоксин. Штамм P wapA -gfp выращивали, как описано на фиг. 1, и уровни флуоресценции GFP измеряли с помощью проточной цитометрии. Для каждого штамма показаны два набора данных. (B) Анализ конкуренции со штаммом дикого типа и мутантом Δ wapAI ( gfp ) на средах MSgg, 2×SGG и LB в различных генетических фонах.Долю репортерных штаммов GFP в колониях представляли как среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3). (C) Защита стада не защитила от WapA. Анализы конкуренции проводились на LB с использованием разбавленных культуральных смесей ( n = 3). (D) Морфология колоний в конкурентных анализах на LB. Морфологию колоний и флуоресценцию GFP наблюдали с помощью стереомикроскопа через 24 ч после инокуляции. (E) Анализ конкуренции со штаммом дикого типа и мутантом Δ wapAI ( gfp ) в LB в условиях встряхивания ( n = 3).

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009682.g009

    Мы предположили, что системы токсин-антитоксин WapAI и LXG могут функционировать в разных условиях. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели анализ конкуренции один к одному между диким типом и мутантом Δ wapAI на трех твердых средах. Доля мутанта Δ wapAI в смешанных колониях снизилась до <5% к 12 часам на LB, тогда как доля мутанта Δ wapAI медленно уменьшалась или оставалась почти постоянной через 24 часа на MSgg и 2×SGG, соответственно (фиг. 9B).Таким образом, WapA оказывал меньший эффект в средах MSgg и 2×SGG, поддерживающих образование биопленок. Этот эффект не был связан со снижением экспрессии wapAI , поскольку wapAI экспрессировался в MSgg и 2×SGG на уровнях, сравнимых или превышающих уровни в LB (фиг. 9A). Чтобы проверить, могут ли механизмы, связанные с образованием биопленки, влиять на опосредованные WapA эффекты, мы провели те же анализы конкуренции в Δ epsA O , Δ tapA tasA и Δ epsA – . Δ tapA tasA фоны.Хотя Δ EPSA O или δ TAPA TAPA TASA Место мутации не повлияло на результаты, полученные с мутантным мутангом δ WAPAI , в Δ EPSA O δ Tapa – на фоне tasA доля мутанта Δ wapAI достоверно снижалась к 12 ч на всех трех средах (рис. 9Б). Принимая во внимание профили экспрессии wapAI , эти результаты показывают, что WapAI опосредует межклеточную конкуренцию в условиях отсутствия биопленки или до начала образования биопленки.

    Сравнение свойств токсинов WapA и LXG, функционирующих в различных условиях, должно помочь понять токсины LXG. В анализах конкуренции мутант Δ wapAI полностью проигрывал дикому типу на твердой LB, даже когда начальная плотность клеток уменьшалась в 100 раз (фиг. 9C). Некоторые клетки Δ wapAI выживали в смешанных колониях, когда исходная плотность клеток уменьшалась в 1000 раз. Однако в этом случае начальная плотность клеток была настолько низкой, что клетки в пятне образовывали множественные небольшие колонии; тем не менее, мутант Δ wapAI исчез из внешних областей пятна, где небольшие колонии сливались вместе, а доля мутанта Δ wapAI в колониях со временем уменьшалась (рис. 9C и 9D).Таким образом, коллективная защита вряд ли защитит клетки от WapA. Более того, когда штаммы дикого типа и мутантных штаммов wapAI совместно культивировали в жидкой LB при энергичном встряхивании, мутант Δ wapAI проигрывал штамму дикого типа. Таким образом, в отличие от токсинов LXG, WapA опосредует конкуренцию в условиях культивирования при встряхивании (Fig. 9E). В совокупности эти результаты показывают, что системы токсин-антитоксин WapAI и LXG обладают разными свойствами. Б . subtilis использует различные системы токсин-антитоксин CDI для конкуренции в зависимости от способа роста.

    Обсуждение

    Полиморфные токсины CDI играют важную роль в межбактериальной конкуренции между родственными штаммами в условиях отсутствия биопленки. Однако, поскольку активность многих антибиотиков и токсинов, в том числе токсинов ИКД, ингибируется в биопленках [29–38], их функция в биопленках остается неясной. Здесь мы показываем, что системы токсин-антитоксин LXG специфически опосредуют внутривидовую конкуренцию в биопленках, вероятно, как системы токсин-антитоксин CDI. Напротив, другая система токсинов CDI, WapAI, опосредовала внутривидовую конкуренцию только в условиях отсутствия биопленки.Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что B . subtilis продуцирует специальные токсины ИКД, которые могут опосредовать межбактериальную конкуренцию в уникальной биопленочной среде.

    В . Штаммы subtilis имеют различные токсины LXG, количество и разнообразие которых достаточно, чтобы отличить каждый штамм. Таким образом, B . Штаммы subtilis могут атаковать друг друга, а системы токсин-антитоксин LXG, вероятно, опосредуют взаимный антагонизм между B . штаммов subtilis (рис. 1В). Токсины LXG, вероятно, поставлялись конкурентам компанией T7SS под номером B . subtilis , как видно из S . промежуточный [45]. Однако существуют различия в механизме доставки токсина LXG двумя бактериями. С . intermedius имеет три гена токсина LXG, каждый из которых образует оперон с родственными генами антитоксина и белка WXG100 [45]. Доставке трех токсинов LXG способствовали различные белки WXG100 в S . промежуточный [45]. Напротив, в B . subtilis , опероны токсин-антитоксин LXG не содержат генов белка WXG100, а функция шести токсинов LXG зависела от одного белка WXG100, YukE в B . субтилис . Это различие может быть связано с различиями в доменах LXG; то есть домены LXG S . Токсины intermedius LXG менее похожи друг на друга, тогда как домены LXG B . Токсины subtilis и LXG сходны друг с другом (рис. S1).

    Токсины

    LXG оказывали свое действие на конкурентов только в условиях биопленки. В отличие от других токсинов CDI, включая токсин WapA, токсины LXG не проявляли своих эффектов при встряхивании культур. Токсины LXG S . intermedius проявляли свое действие в твердой, но не в жидкой среде [45]. Эти наблюдения предполагают, что токсины LXG, вероятно, требуют длительного контакта с клетками для доставки токсина. Активность пяти токсинов LXG, YeeF, YobL, YokI, YqcG и YwqJ, полностью или частично зависела от наличия оперонов epsA и tapA , необходимых для синтеза экзополисахаридов и амилоидных волокон TasA [20, 55–57].В биопленках B . Клетки subtilis образуют пучки клеточных цепей, которые удерживаются вместе экзополисахаридами и амилоидными волокнами TasA [20,55–57]. Потребность в экзополисахаридах и амилоидных волокнах TasA указывает на то, что образование пучков необходимо для доставки этих токсинов LXG. Близкое и нематическое расположение клеток в пучках, вероятно, облегчает доставку токсинов от продуцентов к реципиентам. Однако, хотя мутации Δ epsA-O и Δ tapA-tasA предотвращают образование пучков, токсины YeeF, YokI, YqcG и YwqJ по-прежнему проявляли частичную токсичность на фоне этих мутаций, предполагая, что экзополисахариды и амилоидные волокна TasA, вероятно, играют другую роль в Доставка токсина LXG.В отличие от токсинов LXG, токсин WapA не проявлял своего действия в биопленках, и его действие затруднялось присутствием экзополисахаридов и полимеров TasA. Эти наблюдения предполагают, что тесное и нематическое выравнивание клеток недостаточно для доставки токсинов CDI, и взаимодействие между матричными полимерами и токсинами или устройствами доставки токсинов может сильно влиять на их доставку. Эти взаимодействия, вероятно, предотвращают доставку WapA, но облегчают доставку этих пяти токсинов LXG. Напротив, активности токсина YxiD не препятствовали мутации Δ epsA-O и Δ tapA-tasA .Однако токсин YxiD проявлял свое действие только в условиях биопленки. Для доставки токсина YxiD может потребоваться неизвестный внеклеточный фактор, связанный с биопленкой. Мы показали, что токсины LXG доставлялись зависимым от T7SS и YukE (WXG100) образом, как это наблюдалось в S . промежуточный [45]. Однако наше понимание механизма доставки этих токсинов остается ограниченным, и для выяснения механизма доставки требуется дальнейшая работа.

    Выводы о том, что каждый B .Штамм subtilis обладает от трех до девяти различных систем токсин-антитоксин LXG, что позволяет предположить родственную дискриминацию штамма B . Биопленки subtilis являются исключительно исключительными, как предполагалось ранее [8,28]. Эта система дает преимущества, которые могут улучшить доступ к пространству и ресурсам. Поскольку близкие родственные штаммы могут быть сильными конкурентами и потенциально могут эффективно использовать больше внеклеточных продуктов из-за их генетического родства, высокоэксклюзивная система может быть решением для защиты клеток биопленки от конкуренции и социальной эксплуатации.Помимо дискриминации по роду, системы токсин-антитоксин LXG, вероятно, играют еще одну роль. В экспериментах по совместному культивированию штамм 3610 и несколько природных изолятов сосуществовали, но были пространственно разделены в биопленках колоний. Мутация T7SS Δ yukE- D, препятствовавшая доставке токсина LXG, изменила характер сегрегации. Эти наблюдения показывают, что токсины LXG также участвуют в пространственной сегрегации в биопленках. Поскольку нападение провоцирует контратаку, а лизис конкурентов может привести к высвобождению клеточных токсинов и вредных молекул [63–65], чрезмерное участие в военных действиях по устранению конкурентов дорого и рискованно, особенно для клеток биопленки, закрепленных в матрице и неспособных к перемещению. без труда.Пространственная сегрегация может помочь избежать чрезмерных войн. Было показано, что взаимный антагонизм между продуцентами токсина CDI приводит к такой сегрегации [53,66,67]. Однако в экспериментах по совместному культивированию двух штаммов, каждый из которых продуцировал свой токсин LXG, сильные продуценты токсина LXG стали доминирующими. Пространственная сегрегация наблюдалась только тогда, когда два штамма продуцировали токсины LXG с сопоставимой эффективностью. Таким образом, продукции одного токсина LXG не всегда достаточно для запуска пространственной сегрегации. Мы показали, что некоторые штаммы, продуцирующие два относительно слабых токсина LXG, были способны конкурировать со штаммом, продуцирующим наиболее мощный токсин YxiD, и совместное культивирование этих штаммов приводило к их пространственному раздельному росту.Эти наблюдения указывают на то, что производство множества разнообразных токсинов LXG, а не одного, может быть важным для управления пространственной сегрегацией в биопленках.

    Пространственная сегрегация, вероятно, является результатом короткодействующих свойств токсинов ИКД и защиты стада. Несмотря на различия в активности, все шесть токсинов LXG были чувствительны к жесткой защите. Считается, что защита стада происходит следующим образом; когда кластеры двух разных производителей токсина CDI сталкиваются, соседние конкуренты атакуют друг друга.Это вызывает накопление мертвых клеток на межштаммовой границе, что создает барьер для блокирования дальнейшей атаки продуцентов токсина CDI [53,66,67]. Учитывая этот механизм, оставление мертвых клеток нетронутыми, вероятно, эффективно для защиты стада. Мы показали, что индукция шести токсинов LXG вызывает немедленное прекращение роста, но не быстрый лизис клеток. Таким образом, атака этих шести токсинов LXG, вероятно, оставляет мертвые клетки нетронутыми, а это означает, что токсины LXG обеспечивают защиту стада. Однако коллективная защита не всегда эффективна против токсинов ИКД.Токсины CDI, которые являются мощными и быстро лизируют клетки, могут устранять конкурентов, даже когда они находятся в кластерах [67]. Мы заметили, что стадная защита была неэффективна против WapA, который функционировал в условиях отсутствия биопленки, хотя его механизм остается неясным. Свойства токсинов LXG, чувствительные к защите стада, могут быть важны для клеток, живущих в биопленке, чтобы избежать чрезмерной войны и способствовать разнообразию биопленки.

    Токсины

    LXG могут быть не единственными токсинами, действующими в биопленках. Б . subtilis продуцировал два типа токсинов CDI, в зависимости от режима роста. Мы показали, что двухкомпонентная система DegS-DegU активирует транскрипцию четырех оперонов токсин-антитоксин LXG в дополнение к оперону yukE , кодирующему T7SS [49], и отрицательно регулирует транскрипцию оперона wapAI . Эти наблюдения позволяют предположить, что использование противомикробных препаратов в зависимости от способа роста частично контролируется посредством регуляции транскрипции с помощью DegS-DegU. В дополнение к оперонам токсин-антитоксин LXG, DegS-DegU активирует транскрипцию оперона yitP (продукция токсина YIT) и оперона bacA (синтез бацилицина) и репрессирует оперон srfA (синтез сурфактина) [26, 68]. ,69].Репрессия оперона srfA косвенно индуцирует синтез плипастатина [68]. Эти DegS-DegU-зависимые антибиотики и токсины могут вносить вклад в механизмы конкуренции, специфичные для биопленок. Распространение этих антибиотиков и токсинов в B . subtilis штаммов различались. Каждый из них, вероятно, защищает B . subtilis от разных конкурентов в области биопленок.

    Методы

    Бактериальные штаммы и условия культивирования

    В . subtilis , штамм NCIB 3610 и производные, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 3. Конструкция B . Мутанты subtilis описаны в тексте S1. Праймеры, используемые для конструирования штаммов, перечислены в таблице S2. Природные изоляты B . subtilis были любезно предоставлены H. Takamatsu и R. Kuwana, а их последовательности gyrA были описаны ранее [58]. Б . Штаммы subtilis выращивали в MSgg (5 мМ фосфата калия (pH 7), 100 мМ MOPS (pH 7), 2 мМ MgCl 2 , 700 мкМ CaCl 2 , 50 мкМ MnCl 2 M Fe Cl 50 3 , 1 мкМ ZnCl 2 , 2 мкМ тиамина, 0.5% (вес/объем) глицерина, 0,5% (вес/объем) глутамата, 50 мкг/мл триптофана) [20], 2×SGG (16 г/л питательного бульона (BD Difco, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США), 0,2% (мас./об.) KCl, 2 мМ MgSO 4 ·7H 2 O, 1 мМ Ca(NO 3 ) 2 , 0,1 мМ MnCl 2 , 1 мкМ Fe12 90 [ , 1 мкМ Fe12 90 50] или LB (LB Lennox; BD Difco). Е . Штаммы coli HB101 и JM105 использовали для конструирования и поддержания плазмид.

    Выделение ДНК и РНК

    Культуры (2 мл) B .Штаммы subtilis , выращенные в течение ночи при 28°C в LB, добавляли к 100 мл LB, и штаммы выращивали при встряхивании при 37°C. Когда ОП 600 достигала 0,7–0,8, к культурам добавляли ИПТГ (конечная концентрация 1 мМ). До и через 1 ч после добавления ИПТГ клетки (5 OD) осаждали в пробирку на 15 мл центрифугированием (5800×g в течение 2 мин) и немедленно замораживали в жидком азоте. Размороженные клетки растворяли в 1 мл буфера LETS (10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 50 мМ LiCl, 10 мМ ЭДТА, 1% додецилсульфата натрия), а затем 0.Добавляли 7 мл стеклянных шариков (диаметром 0,35–0,5 мм) и 1 мл фенол-хлороформ-изоамилового спирта (25:24:1, рН 8,0). После встряхивания в течение 5 мин образцы центрифугировали при 5800×g в течение 10 мин при 4°С. 0,6 мл водной фазы переносили в пробирку на 1,5 мл и затем смешивали с 0,6 мл изопропанола. Образцы центрифугировали при 17400×g в течение 20 мин при 4°С, затем осадки ресуспендировали в 100 мкл стерилизованной воды. Один мкл образцов анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле.

    Окрашивание йодидом пропидия

    через 1 ч после индукции токсинов LXG, 1.5 мл клеток осаждали центрифугированием (17400×g, 2 мин). Клетки ресуспендировали в 300 мкл 10 мМ Tris-HCl (pH 7,6) и затем смешивали с 700 мкл этанола. Для фиксации клеток суспензии выдерживали при 4°С в течение ночи. 200 мкл суспензий центрифугировали при 17400 g в течение 2 мин. Клетки ресуспендировали в 100 мкл PBS (1,37 мМ NaCl, 81 мМ NaCl, 81 мМ Na 2 HPO 4 , 26,8 мМ KCl, 14,7 мМ KH 2 PO 2 PO 4 ), содержавшего 0,1 мкг гиоцида/мл пропидия. 20 минут в темноте.Окрашенные йодидом пропидия клетки анализировали с помощью проточной цитометрии.

    Анализы конкуренции

    Культуры (150 мкл) B . Штаммы subtilis , выращенные в течение ночи при 28°C в LB, добавляли к 5 мл LB и штаммы выращивали при встряхивании при 37°C до тех пор, пока OD 600 не достигала 0,7–0,8. Затем культуры разбавляли до OD 600 0,5 с помощью LB, и два разведения культур (каждое по 500 мкл) хорошо перемешивали встряхиванием. Два микролитра смесей наносили на твердую среду, а оставшийся объем использовали для определения соотношения двух штаммов в момент времени 0 с помощью проточной цитометрии.Засеянные чашки инкубировали при 30°С. Через 12, 24 или 48 часов собирали колонии для определения соотношения двух штаммов с помощью проточной цитометрии. Для 12-часовых образцов собирали две или три колонии, а для 24-часовых и 48-часовых образцов собирали одну колонию. Соотношения двух штаммов в каждый момент времени определяли путем усреднения трех экспериментов. Необработанные данные отображаются в наборе данных S1. Для анализа конкуренции в жидкой среде MSgg смеси двух культур готовили аналогичным образом, и 30 мкл смесей добавляли к 5 мл MSgg или LB.Один мл жидких культур собирали для анализа методом проточной цитометрии. Соотношение двух штаммов в 24-часовых культурах также определяли путем усреднения трех опытов.

    Анализ методом проточной цитометрии

    Колонии

    соскребали с помощью инокуляционных петель и суспендировали в 300 мкл PBS. После того, как суспензия была хорошо диспергирована повторным пипетированием, клетки осаждали центрифугированием при 17400 g в течение 1 мин. Аналогичным образом клетки жидких культур осаждали центрифугированием при 17400 g в течение 1 мин.Затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 7 мин [72]. Перед проточным цитометрическим анализом клетки биопленки подвергали легкой обработке ультразвуком [72]. Флуоресценцию одиночных клеток измеряли с помощью проточного цитометра Accuri C6 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Количество зарегистрированных событий составило 50 000. Порог был установлен на уровне 20 000 на FSC-H.

    Выражение репортеров GFP

    Для измерения экспрессии репортеров GFP, B . Штаммы subtilis выращивали с использованием процедур, аналогичных описанным для конкурентных анализов, за исключением того, что два штамма не смешивали.Экспрессию репортеров GFP измеряли с помощью проточной цитометрии, как описано выше.

    Микроскопия

    Выражение репортеров GFP в B . Колонии subtilis анализировали с помощью стереомикроскопа SZX7 (Olympus, Токио, Япония), оснащенного цифровой цветной камерой AdvanCam-E3Rs (Advan Vision, Токио, Япония), как описано ранее [26]. Изображения были получены и обработаны с помощью AdvanView (Advan Vision) и Photoshop Elements (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния, США).Эксперименты проводились не менее трех раз, и репрезентативные примеры показаны на рисунках.

    Идентификация новых однонуклеотидных полиморфизмов для помощи в картировании распространения Bacillus anthracis на Южном Кавказе аллельное состояние двух canSNP, A.Br.2 (наследственный аллель) и A.Br.3 (производный аллель), таким образом, образуя группу canSNP A.Бр.002/003. Недавно в эту схему типирования были внесены поправки

    16 , чтобы признать растущее генетическое разнообразие патогена, обнаруженное в течение предыдущего десятилетия. Согласно новой схеме терминальная линия A.Br.Aust94 теперь определяется производным аллельным состоянием нового canSNP A.Br.014 25 . Эта клада, A.Br.Aust94 (теперь определяемая как A.Br.002 [предковая]/A.Br.014 [производная]), географически широко распространена, поскольку члены были изолированы из Австралии, Африки (Южная Африка, Намибия, Мозамбик и др.), Азии (Турция, Грузия, Таиланд, Индия, Китай и др.), Америки (США) и Европы (Германия, Великобритания, Нидерланды и др.) 10,16 . Генотипирование подтвердило тесную связь грузинских и восточно-анатолийских штаммов с изолятами обеих стран, попадающими в новые производные подлинии узла A.Br.015/013 внутри группы canSNP A.Br.Aust94 25 . Дальнейшее типирование с помощью «GeoSNP» 10 восточно-анатолийских штаммов (таблица 1) показало, что эти штаммы сгруппированы вдоль линий A.Бр.027/026, А.Бр.029/028 или А.Бр.030/029 соответственно 8 .

    В ходе работы мы опирались на предыдущие схемы SNP-типирования 10,25 и добавили три новые определенные группы, Kafkas-Geo 1–3, включающие недавно секвенированные геномы из провинции Карс, а также ранее генотипированные геномы из Турции. и Грузия. Объединив новую информацию на основе генома и более раннюю информацию, полученную с помощью ПЦР 8 , мы смогли сгруппировать все тридцать штаммов из провинции Карс в улучшенную схему типирования (дополнительный рис.S1, таблица 3). Тем не менее, нужно помнить, что все еще существует предвзятость открытия, поскольку штаммы, находящиеся в коллекциях, безусловно, не все репрезентативны, а просто случайные снимки разнообразия, присутствующего в регионе Южного Кавказа. Кроме того, не все штаммы доступны для секвенирования генома, что делает филогенетическую оценку немного нечеткой, если полагаться только на MLVA-анализ и частичное исследование SNP.

    Это также было проблемой для анализа штаммов «Кафкас».Три из тридцати штаммов из провинции Карс (Kafkas-107, -173 и -183) демонстрировали предковые состояния SNP для всех трех SNP-групп Kafkas-Geo (таблица 3). Дальнейшее генотипирование на основе SNP с использованием опубликованной информации SNP 10,25 подтвердило размещение штаммов между SNP-группами Kafkas-Geo 1–3, как опубликовано для SNP A.Br. 26–33 в 8 . Примечательно, что штаммы Kafkas-107 и -183, которые определены как A.Br.029/028, и штамм Kafkas-173 как A.Br.028/027, соответственно 8 , не кластеризуются с Kafkas-Geo SNP-группами 1. –3.В предыдущем дереве, полученном из MLVA, 8 Kafkas-107, -173 и -183 зажаты между кладой штаммов, которые теперь помещены в группу 2 Kafkas-Geo вместе с двумя штаммами (Kafkas-78 и Kafkas-86). теперь известно, что они принадлежат к группе 3 Kafkas-Geo. В нашей новой схеме, основанной на SNP (дополнительный рисунок S1), штаммы Kafkas-107 и -183 будут разветвляться между позициями «d» (SNP A.Br.028) и f ( A.Br.29) возможны общие производные SNP со штаммом Ba-9065/08-Geo. И наоборот, штамм Kafkas-173 ответвится раньше, между одним из SNP, помеченным «b» (A.Br.026) и четыре SNP «c», включающие A.Br.027 (SNP A.Br. 026–29, 10 ). Из этого теоретического узла между «b» и «c» исходят и другие штаммы из Турции (A001, A0103 и A0148). Однако на данный момент неизвестно, с каким из этих штаммов изолят Kafkas-173 имеет общие производные состояния SNP. Кроме того, голландский штамм CVI-188678-1 (A.Br.027/026) 24 , возможно, очень тесно связан с Kafkas-173 и другими турецкими штаммами из дополнительного рисунка S1, поскольку эти и турецкие изоляты A001, A0103 и A0148 были определяются идентичными SNP-состояниями (A.Бр.027/026).

    Используя информацию на основе SNP, относящуюся к A.Br. 026–033 из 10 на 30 штаммах из Грузии 8 можно отнести эти изоляты к кладам, изображенным на дополнительном рисунке S1. Грузинские штаммы (все штаммы изначально имели суффикс «-G») 1242, 6150, 6671, 8295 относятся к группе Kafkas-Geo 3 (производной для SNP A.Br.029), а штаммы 89, 91, 154, 406, 762, 1998, 7763, 8263, 8276, 8889, 8903, 9105, 9107, 9450 (A.Br.029/028) могут принадлежать группе Кафкас-Гео 2 или линии, включающей грузинский штамм Ba-9065/08-G 13 .Менее определенным является размещение штаммов 368, 392, 411, 8347, 8500, 8670 и 9630 (все A.Br.028/027), ответвляющихся перед положением «d» (SNP A.Br.028), но после любого положения обозначен «c» (A.Br.027) на дополнительном рисунке S1. Таким образом, эти изоляты могут быть наиболее тесно связаны со штаммами с секвенированным геномом 9080-G 10 и Ba-8776/92 13 . Наконец, единственный изолят 52-G, который ранее располагался в терминальной ветви, поскольку было обнаружено, что он демонстрирует производные аллельные состояния для всех протестированных SNP 10 , составляет подветвь в Kafkas-Geo-группе 3 (все члены происходят от A .Br.029) в текущей модели (дополнительный рисунок S1). Таким образом, к этой группе также принадлежат грузинские штаммы из 8 , названные 50, 9099, 9102 и 9104.

    . экологически хорошо зарекомендовал себя в Грузии, (Восточной) Турции 6,8,10,11 и, возможно, в других странах Южного Кавказа. Недавние усилия по секвенированию генома дополнительных штаммов, выделенных из этого географического региона, и обнаружение SNP теперь позволяют составить карту генетического разнообразия B с постоянно увеличивающимся разрешением.сибирская язва . Будет интересно посмотреть, в какой степени линия A.Br.Aust94 с соответствующими кладами проникает в соседние страны. Эти усилия по филогеографическому типированию генома также помогут нам лучше понять, как европейские, американские или австралийские штаммы, которые, вероятно, были завезены из регионов, где линия A.Br.Aust94 экологически установлена ​​ 10 , вписываются в картину. В меньших масштабах, в случае с Турцией, было высказано предположение, что перевозка (зараженного) скота между Восточной Анатолией и Западной Турцией была основным маршрутом B.anthracis и, таким образом, вероятный завоз штаммов A.Br.Aust94 в западную часть страны 6 . Доминирование линии A.Br.Aust94 подчеркивает уникальность региона Карс по сравнению с остальной частью Турции и подчеркивает сильную географическую структуру. Это похоже на то, что происходит в Грузии, и предполагает эффективное управление для ограничения распространения патогенов.

    Характеристика изолятов Bacillus из окружающей среды с помощью фингерпринтинга белков и профилей случайной амплификации полиморфной ДНК

  • Слепецки Р.А., Хемфилл Х.Е. (1992) Род Bacillus немедицинский в «Прокариотах».Спрингер, Нью-Йорк, стр. 1697–1745

    Google ученый

  • Назина Т.Н., Турова Т.П., Полтараус А.Б., Новикова Е.В., Григорян А.А., Иванова А.Е., Лысенко А.М., Петруняка В.В., Осипов Г.А., Беляев С.С., Иванов М.В. (2001) Таксономическое изучение аэробных термофильных палочек: описания Geobacillus подземный род. ноябрь, сп. ноябрь и Geobacillus uzenensis sp. ноябрь из нефтяных пластов и перенос Bacillus stearothermophilus , Bacillus thermocatenulatus , Bacillus thermoleovorans , Bacillus kaustophilus , Bacillus thermodenitrificans в комбинацию Geobacillus 9 как новую комбинацию G00.stearothermophilus , G. th. Int J Syst Evol Microbiol 51 (Pt 2): 433–446

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Ash C, Farrow JAE, Wallbanks S, Collins MD (1991) Филогенетическая гетерогенность рода Bacillus, выявленная сравнительным анализом последовательностей малых субъединиц рибосомной РНК. Lett Appl Microbiol 13(4):202–206. doi:10.1111/j.1472-765X.1991.tb00608.x

    КАС Статья Google ученый

  • Carrasco IJ, Márquez MC, Xue Y, Ma Y, Cowan DA, Jones BE, Grant WD, Ventosa A (2007) Bacillus chagannorensis sp.nov., умеренный галофил из содового озера во Внутренней Монголии, Китай. Int J Syst Evol Microbiol 57 (Pt 9): 2084–2088

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Ronimus RS, Parker LE, Turner N, Poudel S, Rückert A, Morgan HW (2003) Сравнение термофильных бацилл из сухого молока на основе RAPD. Int J Food Microbiol 85(1–2):45–61

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Weiss A, Domig KJ, Kneifel W, Mayer HK (2010) Оценка методов типирования на основе ПЦР для идентификации пробиотических штаммов Enterococcus faecium из кормов для животных.Anim Feed Sci Technol 158: 187–196

    CAS Статья Google ученый

  • Франклин Р.Б., Тейлор Д.Р., Миллс А.Л. (1999) Характеристика микробных сообществ с использованием случайно амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD). J Microbiol Methods 35(3):225–235

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Welsh J, McClelland M (1990) Отпечатки геномов с использованием ПЦР с произвольными праймерами.Рез. нуклеиновых кислот 18(24):7213–7218

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV (1990) полиморфизмы ДНК, амплифицированные произвольными праймерами, можно использовать в качестве генетических маркеров. Рез. нуклеиновых кислот 18(22):6531–6535

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Arslan E, Çelebi A, Açık L, Uçan US (2009) Характеристика коагулазоположительных видов Staphylococcus , выделенных при мастите крупного рогатого скота с использованием белковых и плазмидных моделей.Turk J Vet Anim Sci 33(6):493–500

    CAS Google ученый

  • Aslantas O, Ozturk F, Celebi A, Acik L, Ergun Y (2006) Характеристика штаммов Staphylococcus aureus , выделенных при субклиническом мастите крупного рогатого скота, по структуре белков, устойчивости к антибиотикам и плазмидному профилю. Ankara Üniv Vet Fak Derg 53:47–51

    Google ученый

  • Berber I, Alan N, Ekin S, Onlu H (2010) Использование различных методов электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) в характеристике патогенных для человека Staphylococcus aureus starins.Азиатский J Chem 22(4):3173–3185

    CAS Google ученый

  • Костас М., Слосс Л.Л., Оуэн Р.Дж., Гастон М.А. (1989) Оценка численного анализа SDS-PAGE белковых структур для типирования Enterobacter cloacae . Epidemiol Infect 103(2):265–274

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Da Silva Santos OC, Laport MS, Teixeira LM, Giambiagi-DeMarval M, Iorio NL, dos Santos KR (2009) Надежная идентификация клинически распространенных видов и подвидов стафилококков с помощью анализа электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.Diagn Microbiol Infect Dis 64(1):1–5. doi:10.1016/j.diagmicrobio.2008.12.017

    Артикул пабмед Google ученый

  • Millership SE, Want SV (1992) Электрофорез белков целых клеток для типирования Mycobacterium tuberculosis . J Clin Microbiol 30(11):2784–2787

    CAS пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Нагар В., Шашидхар Р., Бандекар Дж. Р. (2013) Характеристика штаммов Aeromonas, выделенных из индийских пищевых продуктов, с использованием секвенирования гена rpoD и анализа белков целых клеток.World J Microbiol Biotechnol 29(4):745–752. дои: 10.1007/s11274

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Оздемир К., Бербер И., Огюн Э., Аталан М. (2013) Определение профилей общего клеточного белка видов Streptomyces. J Exp Biol Agric Sci 1(3):187–190

    Google ученый

  • Патнаик С., Прассад А., Гангули С. (2014) Характеристика SDS-PAGE Staphylococcus spp.выделены из случаев мастита крупного рогатого скота. Int J Rec Biotech 2(1): 1–3. ISSN: 2322–0392

  • Сантос О.Д., Де Резенде МСС, Де Мелло А.Л., Фраззон АПГ, Д’Азеведо П.А. (2012) Использование анализа профиля белков целых клеток с помощью SDS-PAGE в качестве точного инструмента для идентификации видов и подвиды коагулазонегативных стафилококков. АПМИС 120(1):39–46

    Статья пабмед Google ученый

  • Berber I, Cokmus C, Atalan E (2003) Характеристика видов Staphylococcus с помощью SDS-PAGE цельноклеточных и внеклеточных белков.Микробиология 72(1):42–47

    CAS Статья Google ученый

  • Бербер I (2004) Характеристика видов Bacillus путем численного анализа их белковых профилей в SDS-PAGE. J Cell Mol Biol 3:33–37

    Google ученый

  • Niemi RM, Niemelä SI, Bamford DH, Hantula J, Hyvärinen T, Forsten T, Raateland A (1993) Предположительные фекальные стрептококки в образцах окружающей среды, охарактеризованные одномерным электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.Appl Environ Microbiol 59(7):2190–2196

    CAS пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Бурку Э., Озкараова Г., Оркун М.О. (2014) Фракционирование, подвижность и источники отдельных тяжелых металлов в верхних слоях почвы в Среднечерноморском регионе Турции. ЧИСТАЯ Почва Воздух Вода 42(7):986–993

    Артикул Google ученый

  • Ammoneh H, Harba M, Akeed Y, Al-Halabi M, Bakri Y (2014) Выделение и идентификация местных изолятов Bacillus для биосинтеза ксиланазы.Иран J Microbiol 6(2):127–132

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  • Kim HS, Lee DW, Woo SD, Yu YM, Kang SK (1998) Распространение, серологическая идентификация и ПЦР-анализ Bacillus thuringiensis , выделенных из почв Кореи. Curr Microbiol 37:195–200

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG (1986) Руководство Берджи по систематической бактериологии, том 2.The Williams and Wilkins Co, США

    Google ученый

  • Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Молекулярное клонирование: лабораторное руководство, 2-е изд. Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк

    Google ученый

  • Laemmli UK (1970) Расщепление структурных белков во время сборки головки бактериофага Т4. Природа 227:680–685

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Wessel D, Flügge UI (1984) Метод количественного выделения белка в разбавленном растворе в присутствии детергентов и липидов.Anal Biochem 138(1):141–143

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Stackebrandt E, Goebel BM (1994) Таксономическое примечание: место для реассоциации ДНК-ДНК и анализа последовательности 16S рРНК в существующем определении вида в бактериологии. IJSEM 44 (4): 846–849. дои: 10.1099/00207713-44-4-846

    КАС Google ученый

  • Шафиани С., Малик А. (2003) Толерантность к пестицидам и устойчивость к антибиотикам у бактерий, выделенных из почвы, орошаемой сточными водами.World J Microbiol Biotechnol 19:897–901

    CAS Статья Google ученый

  • Гупта П., Гупта М.К., Сингхал П.К. (2011) Молекулярные методы для быстрой общей идентификации изолятов из окружающей среды Bacillus spp. Adv Biotech 10(12):11–15

    Google ученый

  • Saxena S, Verma J, Shikha Modi DJ (2014) RAPD-PCR и 16S rDNA филогенетический анализ бактерий, продуцирующих щелочную протеазу, выделенных из почвы Индии: идентификация и выявление генетической изменчивости.J Genet Eng Biotechnol 12(1):27–35

    Статья Google ученый

  • Rückert A, Ronimus RS, Morgan HW (2004) Исследование термофильных бацилл в сухом молоке из разных стран на основе RAPD. Int J Food Microbiol 96(3):263–272

    Статья пабмед Google ученый

  • Юань Д.Д., Лю Г.К., Рен Д.Ю., Чжан Д., Чжао Л., Кан С.П., Ян Ю.З., Ма В., Ли И., Чжан Л.Б. (2012) Исследование наличия термофильных бацилл в коммерческом сухом молоке в Китае.Пищевой контроль 25:752–757

    Статья Google ученый

  • Berber I, Cokmus C (2001) Характеристика штаммов Bacillus sphaericus с помощью Native-PAGE. Bull Pure Appl Sci 20B(1):17–21

    Google ученый

  • Аксакал А. (2010) Анализ профилей белков цельных клеток сероваров Salmonella , выделенных из фекалий кур, индеек и овец, с помощью SDS-PAGE.Vet Med 55(6):259–263

    CAS Google ученый

  • Саркар А., Саха М., Патра А., Рой П. (2012) Характеристика Aeromonas hydrophila с помощью анализа RAPD-PCR и SDS-PAGE. Open J Med Microbiol 2:37–40

    Статья Google ученый

  • Berber İ, Berber Ş (2006)Численный анализ белковых структур SDS-PAGE факультативных алкалофильных видов Bacillus , выделенных из озера Ван, Турция.Fresenius Environ Bull 15(5):409–416

    CAS Google ученый

  • Исследовательские статьи, журналы, авторы, подписчики, издатели

     
     
    Как крупный международный издатель академических и исследовательских журналов, Science Alert публикует и разрабатывает игры в партнерстве с самыми престижные научные общества и издательства. Наша цель заключается в проведении высококачественных исследований в максимально широком зрительская аудитория.
       
     
     
    Мы прилагаем все усилия, чтобы поддержать исследователей которые публикуются в наших журналах. Существует огромное количество информации здесь, чтобы помочь вам опубликоваться у нас, а также ценные услуги для авторов, которые уже публиковались у нас.
       
     
     
    2022 цены уже доступны.Ты может получить личную / институциональную подписку на перечисленные журналы непосредственно из Science Alert. В качестве альтернативы вы возможно, вы захотите связаться с предпочитаемым агентством по подписке. Пожалуйста, направляйте заказы, платежи и запросы в службу поддержки клиентов в службу поддержки клиентов журнала Science Alert.
       
     
     
    Science Alert гордится своим тесные и прозрачные отношения с обществом.В виде некоммерческий издатель, мы стремимся к самому широкому возможное распространение материалов, которые мы публикуем, и на предоставление услуг самого высокого качества нашим издательские партнеры.
       
     
     
    Здесь вы найдете ответы на наиболее часто задаваемые вопросы (FAQ), которые мы получили по электронной почте или через контактную веб-форму.В соответствии с характером вопросов мы разделили часто задаваемые вопросы на разные категории.
       
     
     
    Азиатский индекс научного цитирования (ASCI) обязуется предоставлять авторитетный, надежный и значимая информация путем охвата наиболее важных и влиятельные журналы для удовлетворения потребностей глобального научное сообщество.База данных ASCI также предоставляет ссылку до полнотекстовых статей до более чем 25 000 записей с ссылка на цитируемые источники.
       
     

    Сверхчувствительное обнаружение Bacillus anthracis с помощью ПЦР в реальном времени, нацеленной на полиморфизм многокопийных генов 16S рРНК и их транскриптов.Идентификация

    B. anthracis является сложной задачей из-за близкого генетического родства этой бактерии с другими видами группы Bacillus cereus . Таким образом, молекулярное обнаружение основано на видоспецифичной ПЦР, направленной на однокопийные гены. Здесь мы подтвердили ранее признанную многокопийную цель, видоспецифический SNP, присутствующий в 2-5 копиях в каждом проанализированном геноме B. anthracis . Для этого был разработан и тщательно протестирован ПЦР в реальном времени на основе гидролизных зондов.Анализ был специфичным, поскольку только ДНК B. anthracis давал положительные результаты, был линейным в пределах 9 log 10 единиц и был чувствительным с пределом обнаружения (LoD) 2,9 копий/реакцию. Хотя LoD не ниже, чем установленные мишени ПЦР с одной копией ( dhp61 или PL3 ), более высокое число копий B. anthracis -специфического аллеля гена 16S рРНК дает ≤2 единицы нижнего порогового значения (Ct). Чтобы еще больше увеличить предел обнаружения, анализ был адаптирован для ПЦР с обратной транскрипцией на транскриптах 16S рРНК.Этот анализ ОТ-ПЦР также был линейным в пределах 9 log 10 единиц и был чувствительным с пределом обнаружения 6,3 копий/реакция. ДНК-таргетные анализы. Для молекулярной диагностики мы рекомендуем вариант анализа ОТ-ПЦР в реальном времени, в котором и ДНК, и РНК служат в качестве матриц (таким образом, обработка ДНКазой не требуется). Это, по крайней мере, даст результаты, равные реализации на основе ДНК, если не присутствует РНК, но будет лучше даже при самых низких концентрациях остаточной рРНК.

    Заявление о конкурирующих интересах

    Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Заявление о финансировании

    Это исследование финансировалось за счет средств Программы исследований в области медицинской биологической защиты Объединенной медицинской службы Бундесвера. Внешнее финансирование не было получено. никакая третья сторона не участвовала.

    Декларации авторов

    Я подтверждаю, что соблюдены все соответствующие этические нормы и получены все необходимые разрешения IRB и/или комитета по этике.

    Да

    Подробная информация об ЭСО/надзорном органе, предоставившем разрешение или освобождение для описанного исследования, приведена ниже:

    Информация/материалы для пациентов не использовались, разрешения комитета по этике не требуются. ниже 3., 4 и 6. не применяется.

    Получено все необходимое согласие пациента/участника, и соответствующие институциональные формы заархивированы.

    Да

    Я понимаю, что все клинические испытания и любые другие проспективные интервенционные исследования должны быть зарегистрированы в утвержденном ICMJE реестре, таком как ClinicalTrials.правительство Я подтверждаю, что любое такое исследование, указанное в рукописи, было зарегистрировано, и предоставлен идентификатор регистрации исследования (примечание: если публикуется проспективное исследование, зарегистрированное ретроспективно, укажите в поле идентификатора исследования заявление, объясняющее, почему исследование не было зарегистрировано заранее) .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.